[發(fā)明專利]一種高效的綠木霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010190933.7
• 申請(qǐng)日: 2020-03-18
• 公開（公告）號(hào): CN111172187A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 華麗霞;曾華蘭;何煉;蔣秋平;葉鵬盛;劉勇;張敏;王明娟;黃玲;曾靜;韋樹谷;代順冬;賴佳;張騫方
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N1/06
• 代理公司: 成都博通專利事務(wù)所 51208
• 代理人: 陳樹明

1.一種高效的綠木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其步驟如下：

A、農(nóng)桿菌的活化與擴(kuò)大培養(yǎng)

將含有潮霉素抗性基因和目的基因的質(zhì)粒載體，通過電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到農(nóng)桿菌C58C1的感受態(tài)細(xì)胞的T-DNA中，獲得T-DNA中攜帶有所述的質(zhì)粒載體的陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌株；將陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌株,用LB固體培養(yǎng)基26-30℃培養(yǎng)48-60h；隨后，挑取陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌株到LB液體培養(yǎng)基中，26-30℃振蕩培養(yǎng)48-60h；然后，4000rpm離心5min收集陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌株；隨后用IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸浮陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌株，并使懸浮液在600nm波長(zhǎng)的吸光值至0.2-0.3，然后，28℃振蕩培養(yǎng)6h，即得到擴(kuò)大培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌菌液；

B、綠木霉菌分生孢子液的制備

將綠木霉菌用PDA平板培養(yǎng)基、26-30℃活化培養(yǎng)至產(chǎn)生分生孢子，用滅菌水刮洗菌株菌面，并用三層擦鏡紙過濾菌絲，得到分生孢子濾液；將分生孢子濾液4000-5000rpm離心5-10min，倒掉上清液，收集分生孢子；再用濃度0.6-0.8M的NaCl溶液重懸浮分生孢子，并加入Glucanex溶壁酶，加入量為每毫升NaCl溶液加入15-20mg的Glucanex溶壁酶；隨后，30℃下、80rpm振蕩培養(yǎng)2.5-4h；然后，將懸浮液4000rpm離心，棄濾液、得到分生孢子，再用濃度0.6-0.8M的NaCl溶液清洗分生孢子1-2遍，并用單層擦鏡紙過濾殘?jiān)玫骄G木霉菌分生孢子液，并調(diào)節(jié)其濃度至10⁶個(gè)/ml；

C、農(nóng)桿菌與綠木霉菌的共培養(yǎng)

將A步得到的農(nóng)桿菌菌液和B步得到的綠木霉菌分生孢子液，等體積混合得到混合液；再將混合液均勻涂布于共培養(yǎng)平板培養(yǎng)基中，20-24℃暗培養(yǎng)68-76h，得到共培養(yǎng)物；

所述的共培養(yǎng)平板培養(yǎng)基，為每升IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入14-16克的瓊脂粉，凝固而得；

D、轉(zhuǎn)化子的初篩及穩(wěn)定

在PDA固體培養(yǎng)基中加入終濃度為140-160ug/mL的潮霉素抗生素，得到PDA固體篩選培養(yǎng)基；

取PDA固體篩選培養(yǎng)基，將其覆蓋在C步得到的共培養(yǎng)物上，隨后27-29℃培養(yǎng)至PDA固體篩選培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出綠木霉菌菌株；長(zhǎng)出的綠木霉菌菌株即為基因組中插入有農(nóng)桿菌T-DNA的綠木霉菌初篩轉(zhuǎn)化子；

挑取出綠木霉菌初篩轉(zhuǎn)化子，將其接種至另取的PDA固體篩選培養(yǎng)基上，然后，27-29℃培養(yǎng)至PDA固體篩選培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出綠木霉菌菌株；長(zhǎng)出的綠木霉菌菌株即為穩(wěn)定生長(zhǎng)的、基因組中插入有農(nóng)桿菌T-DNA的綠木霉菌轉(zhuǎn)化子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效的綠木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述的IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下方法配制而得：

配制濃度為0.9-1.1M的MES生物緩沖液,并用NaOH調(diào)pH到5.4-5.6；

往400ml的MES生物緩沖液中加入600ml的水；再加入1.5-1.6g的K₂HPO4、1.1-1.3g的KH₂PO₄、5-7g的MgSO₄·7H₂O、2.5-3.5g的NaCl、9-11mg的CaCl₂·2H₂O、47-53mg的NH₄NO₃、4.5-5.5g的甘油、4.5-5.5mg的ZnSO₄·7H₂O、4.5-5.5mg的CuSO₄·5H₂O、4.5-5.5mg的MnSO₄·H₂O、4.5-5.5mg的Na₂MoO₄·7H₂O、4.5-5.5mg的H₃BO₃、18-22mg的葡萄糖、1mg的FeSO₄，得混合液；

將混合液121℃高溫高壓滅菌后，加入終濃度為200μM的乙酰丁香酮，即得。