[發(fā)明專利]美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種多價(jià)滅活疫苗及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010188269.2
• 申請日: 2020-03-17
• 公開（公告）號(hào): CN111388660B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張正;于永翔;王印庚;王學(xué)波;羅展;施琳妮;孫心如;張浩
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): A61K39/02
• 分類號(hào): A61K39/02;A61K39/116;A61P31/04;C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 北京志霖恒遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11435
• 代理人: 許媛媛

1.一種美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于：通過篩選存在致病力和免疫原差異的兩株美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株，分別進(jìn)行全菌滅活后添加枸杞多糖混合制成；

所述的兩株致病力和免疫原差異菌株分別是保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心編號(hào)為：CGMCC No.19466的無致病力菌株，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)；以及保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心編號(hào)為：CGMCC No.19467的強(qiáng)致病力菌株，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

2.如權(quán)利要求1所述的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)活化菌株；

(2)挑選單克隆菌落，培養(yǎng)種子液；

(3)制備美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株發(fā)酵液；

(4)離心后去除上清液，然后對(duì)菌體進(jìn)行重懸，然后滅活；

(5)再次離心后去除上清液收集菌體，調(diào)整濃度，得到全菌滅活菌液；

(6)各取兩株菌檢驗(yàn)合格的滅活菌液，混合后制備成人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的多價(jià)滅活菌液；

(7)取純品枸杞多糖溶解，得到枸杞多糖溶液；

(8)將(6)中的多價(jià)滅活菌液、(7)中的枸杞多糖溶液和緩沖液混合，并震蕩均勻，最終制得美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種多價(jià)滅活疫苗。

3.如權(quán)利要求2所述的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于：吸取制好的滅活菌液涂布于TSB瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)滅活效果，若無菌落長出，證明滅活菌液合格。

4.如權(quán)利要求2所述的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于：步驟(1)活化菌種的培養(yǎng)條件為從-80℃保存的菌種盒中活化兩株菌的菌種，在28℃的條件下，用TSB瓊脂平板培養(yǎng)基單菌落純化培養(yǎng)3次，不低于20h，不超過24h；步驟(2)培養(yǎng)種子液的條件為從TSB瓊脂平板培養(yǎng)基上挑選純化好的一個(gè)單克隆菌落，接種至5ml TSB液體培養(yǎng)基中，在28℃、180rpm震蕩條件下，培養(yǎng)10-12h，作為種子液。

5.如權(quán)利要求4所述的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于：步驟(1)活化菌種的培養(yǎng)條件為從-80℃保存的菌種盒中活化兩株菌的菌種，在28℃的條件下，用TSB瓊脂平板培養(yǎng)基單菌落純化培養(yǎng)3次，每次培養(yǎng)時(shí)間為20-22h。

6.如權(quán)利要求2所述的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于：步驟(3)發(fā)酵的具體操作為：吸取300ul上述培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接至500ml TSB液體培養(yǎng)基中，在28℃、180rpm震蕩條件下，培養(yǎng)16-20h；吸取5ml進(jìn)行梯度稀釋測定OD600，按照Y＝(0.6518X-0.0158)×10⁹cfu/ml公式計(jì)算發(fā)酵液中活菌濃度值，公式中X為OD 600的數(shù)值，Y為發(fā)酵液活菌濃度，OD 600取值僅在0.2～0.8范圍內(nèi)有效；當(dāng)菌液濃度達(dá)到10⁹cfu/ml或以上時(shí)，停止發(fā)酵，制成美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株發(fā)酵液。

7.如權(quán)利要求2所述的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于步驟(4)滅活的具體操作為：用兩個(gè)50ml的離心管，在8000rpm條件下離心5min后倒去上清液，分5次將制備好的500ml發(fā)酵液中的菌體收集至兩個(gè)離心管中；收集完畢后，分別在兩個(gè)離心管中各加入40ml的1.5％無菌NaCl溶液，對(duì)菌體進(jìn)行重懸，并將兩個(gè)離心管中的重懸菌液轉(zhuǎn)移至一個(gè)高溫滅菌的250ml錐形瓶中，補(bǔ)充20ml的1.5％無菌NaCl溶液至總體積為100ml，再加入0.5ml甲醛使其濃度達(dá)到0.5％，然后在4℃、90rpm滅活48h。