[發明專利]一種基于免標記雜交探針競爭法實現低成本高通量核酸適配體最優序列的優化方法

有效

• 申請號: 202010185599.6
• 申請日: 2020-03-17
• 公開（公告）號: CN111445951B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 楊成;張亞旗;曲瑤
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: G16B30/00
• 分類號: G16B30/00;G16B25/20
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 梅洪玉

1.一種基于免標記雜交探針競爭法實現低成本高通量核酸適配體最優序列的優化方法，其特征在于，其包括以下步驟：

步驟1、選取最優互補區及最優互補短鏈探針：

將已獲得的長鏈核酸適配體作為候選核酸適配體，根據全長序列堿基數，規劃出n個區，每個區包含20個堿基，每個區設計7-20個堿基的互補短鏈探針；在室溫下將待表征的長鏈核酸適配體與濃度為0-1000nM的靶標分子在結合溶液中反應5-30分鐘后，加入含有SYBRGreen I的各互補短鏈探針進行反應，實驗結果通過四參數方程進行擬合，四參數方程為：

其中，I_F為熒光響應值；C_OTA為靶標分子濃度；A_max表示四參數方程擬合后獲得的最大值；A_min表示四參數方程擬合后獲得的最小值；IC₅₀表示四參數方程擬合后獲得的半抑制值；式中的p為C_OTA為IC₅₀時擬合曲線的斜率；

通過工作曲線的解析獲得各互補短鏈探針(A_max-A_min)/IC₅₀值，選取(A_max-A_min)/IC₅₀值最大互補短鏈探針，為最優互補短鏈探針；

步驟2、初步獲得較優核酸適配體：

步驟1)中確定的最優互補短鏈探針所對應區為核酸適配體的核心識別區，從原核酸適配的兩端向核心區每次減少3個堿基，設計一系列新的核酸適配體，通過步驟1)的方法獲得新核酸適配體的IC₅₀值，選出IC₅₀值最小的為較優核酸適配體。

步驟3、獲得最短核酸適配體序列：

將步驟2)獲得的較優核酸適配體從核酸適配兩端向核心區每次減少一個堿基，設計一系列一堿基截短核酸適配體，采用步驟1)的方法，將步驟1)中確定的最優互補短鏈探針、靶標分子和各一堿基截短核酸適配體進行反應，獲得各一堿基截短核酸適配體所對應的IC₅₀值，選出IC₅₀值最小的或IC₅₀值較小但結構為尾端互補的為核酸適配體核心序列，即最短核酸適配體序列。

步驟4、構造親和性更高的核酸適配體：

將步驟3)獲得的最短核酸適配體序列，通過結構解析，增加結構穩定性的方法，獲得親和性更高的核酸適配體，即解析序列。

2.根據權利要求1所述的一種基于免標記雜交探針競爭法實現低成本高通量核酸適配體最優序列的優化方法，其特征在于，步驟1)所述的候選核酸適配體為一種序列或多種序列，包括60-100個堿基。

3.根據權利要求1或2所述的一種基于免標記雜交探針競爭法實現低成本高通量核酸適配體最優序列的優化方法，其特征在于，步驟1)所述的互補短鏈探針長度為7-20個堿基。

4.根據權利要求1或2所述的一種基于免標記雜交探針競爭法實現低成本高通量核酸適配體最優序列的優化方法，其特征在于，步驟4)中所述的解析序列的長度為14-45個堿基。

5.根據權利要求3所述的一種基于免標記雜交探針競爭法實現低成本高通量核酸適配體最優序列的優化方法，其特征在于，步驟4)中所述的解析序列的長度為14-45個堿基。

6.根據權利要求1、2或5所述的一種基于免標記雜交探針競爭法實現低成本高通量核酸適配體最優序列的優化方法，其特征在于，步驟1)所述的結合溶液中NaCl的濃度為80-200nM；鈣離子或者鎂離子的濃度為1-30mM；Tris-HCl緩沖溶液的濃度為10-30mM，pH為5-10；表面活性劑為Tween20，其質量分數為0.01％-0.2％。