[發明專利]一種用于檢測2019新型冠狀病毒的凍干型熒光RT-PCR試劑及方法

在審

• 申請號: 202010185453.1
• 申請日: 2020-03-18
• 公開（公告）號: CN111304367A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 黎紹基;林鏡中;歐陽光;卓澤軍
• 申請（專利權）人: 深圳市賽格諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
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本發明提供了一種用于檢測2019新型冠狀病毒的凍干型熒光RT?PCR試劑及方法。該試劑所含的2019新型冠狀病毒的特異性引物和探針從設計上避免了引起假陰性、假陽性和降低反應效率的各種因素，試劑的反應體系經過優化以提高反應效率，并通過冷凍干燥技術制成常溫下穩定的凍干型試劑，避免了常規液體試劑因保存溫度變化或反復凍融而失效的風險。

技術領域

本發明涉及病原微生物的檢測技術，具體地說涉及2019新型冠狀病毒的核酸檢測試劑和方法。

背景技術

冠狀病毒是自然界廣泛存在的一大類病毒，經感染可引起人的呼吸道、消化道和神經系統疾病。冠狀病毒屬于套式病毒目、冠狀病毒科，可分為α、β、γ、δ四個屬，基因組均由線性單股正鏈的RNA組成。目前已發現7種可感染人類的冠狀病毒，即α屬的HCoV-229E和HCoV-NL63，以及β屬的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、 SARS-CoV、MERS-CoV和2019新型冠狀病毒(2019-nCoV，又稱“SARS-CoV-2”)。

2019新型冠狀病毒所致的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)屬于《中華人民共和國傳染病防治法》規定的乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預防、控制措施。以熒光RT-PCR為代表的核酸檢測技術是2019新型冠狀病毒確診的主要方法。 2019新型冠狀病毒疫情爆發后，世界衛生組織(WHO)公開發表了多套新型冠狀病毒熒光RT-PCR檢測的引物和探針序列，但是這些設計普遍存在明顯的缺陷，包括Tm值不合理、探針與引物的相對位置不合理、存在穩定的二級結構(特別是穩定的探針發夾結構)等。目前一些按這些引物探針設計開發的檢測試劑盒在實際檢測中存在檢測靈敏度低、漏檢率高的問題，可能與其設計上的缺陷密切相關。此外，現有的2019新型冠狀病毒熒光RT-PCR檢測試劑均為常規的液體試劑，需要在冷鏈(-20℃)條件下運輸和保存，保存、運輸和使用過程中的溫度升高、反復凍融都會造成試劑的檢測性能下降，影響檢測靈敏度。

現有的2019新型冠狀病毒熒光RT-PCR檢測試劑準確性不足，且對冷鏈有苛刻的要求。2019新型冠狀病毒的防疫工作需要一種更準確可靠，最好無需冷鏈的2019新型冠狀病毒熒光RT-PCR檢測試劑。

發明內容

本發明的目的是提供一種從引物和探針設計上盡量提高準確性和擴增效率、且無需冷鏈的2019新型冠狀病毒凍干型熒光RT-PCR檢測試劑及方法。

本發明所要解決的技術問題通過以下技術方案來實現：

1.引物和探針的設計及反應體系

為從設計上提高準確性，本發明中用于檢測2019新型冠狀病毒核酸的熒光 RT-PCR引物探針組合是基于GISAID、NMDC和GenBank數據庫最新的2019新型冠狀病毒核酸序列信息設計、篩選而得出。其序列如下：

正向引物2019-nCoV-F：5’-CAGCGTTCTTCGGAATGTCG-3’；

反向引物2019-nCoV-R：5’-CCAATTTGATGGCACCTGTGTAG-3’；

探針2019-nCoV-P：5’-CAACCACGTTCCCGAAGGTGTGACTT-3’。

探針2019-nCoV-P的5’端用熒光報告基團標記，3’端用熒光淬滅基團標記。熒光報告基團優選FAM，還可以選用VIC、HEX、JOE、NED、TET、ROX和CY5 中的任意一種；熒光淬滅基團優選BHQ1，還可以選用BHQ2、BHQ3、TAMRA和Eclipse 中的任意一種。

本發明的2019新型冠狀病毒熒光RT-PCR檢測試劑的成分組成如表1所示，加待測RNA樣本和水至25μl的反應體積即可上機檢測。

表1.2019新型冠狀病毒熒光RT-PCR檢測試劑成分