[發明專利]一種甘薯長喙殼菌高效分離方法

在審

• 申請號: 202010184746.8
• 申請日: 2020-03-17
• 公開（公告）號: CN111187725A
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發明（設計）人: 張成玲;謝逸萍;孫厚俊;楊冬靜;馬居奎;唐偉
• 申請（專利權）人: 江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所(江蘇徐州甘薯研究中心)
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12R1/645
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所 32220
• 代理人: 卓小彬

1.一種甘薯長喙殼菌高效分離方法，其特征在于：按如下步驟進行：

步驟（1）、發病樣品保濕：從田間采集甘薯黑斑病發病薯塊樣品，洗凈后，75%酒精表面消毒，采用滅菌刀片，切掉病健交界處一小塊后，滅菌水濕潤的濾紙片敷在發病組織表面保濕，25-28℃條件下，保濕培養4-7 d，看到薯塊表面產生黑色病原物，備用；

步驟（2）、擴繁薯塊準備：取與發病樣品相同的品種或沖繩100新鮮甘薯薯塊，洗凈晾干，75%酒精表面消毒，用滅菌刀將甘薯橫切成厚0.5 cm-1 cm甘薯圓片，即擴繁薯塊，備用；

步驟（3）、孢子混合液制備：切下步驟（1）中的黑色病原物，剁碎放到滅菌培養皿中，每1g樣品加入10 ml滅菌水混勻，放置10 min，制成孢子混合液；

步驟（4）、擴繁薯塊接種：用滅菌鑷子將步驟（2）中準備好的擴繁薯塊，放到孢子混合液中至少30 s，取出后放到滅菌培養皿中，培養皿一側加入吸足水分的脫脂棉進行保濕，蓋好培養皿蓋后25-28℃條件下，培養6 d；

步驟（5）、培養基制備：利用徐薯32薯塊制備甘薯瓊脂培養基，即SPA-xu32培養基，121℃滅菌20 min，冷卻到50℃，每1000 ml SPA-xu32培養基中加入5 ml體積分數為 25%的乳酸，混勻后倒平板，制得含乳酸的SPA培養基，備用；

步驟（6）、病菌分離：步驟（4）擴繁薯塊接種保濕培養6 d，能看到較明顯的刺毛狀物，用滅菌鑷子或挑針挑取表面單個刺毛狀物，放到步驟（5）制得的含乳酸的SPA培養基上，正置10 min后，再倒置培養3-5 d，獲得甘薯長喙殼菌。

2.根據權利要求1所述的一種甘薯長喙殼菌高效分離方法，其特征在于：所述甘薯瓊脂培養基，即SPA-xu32培養基，是將徐薯32薯塊洗凈去皮取200 g，切片加水1000 ml煮沸20min，紗布過濾，稍冷卻再補充水分到1000 ml，取150 ml分裝到含1.5 g瓊脂粉的三角瓶中，加塞、包扎，120℃滅菌20 min后取出，冷卻后貯存備用。

3.根據權利要求1或2所述的一種甘薯長喙殼菌高效分離方法，其特征在于：將體積分數為25％的乳酸溶液與甘薯瓊脂培養基，按照體積比1:200混合均勻，得到含有乳酸的甘薯瓊脂培養基。