[發(fā)明專利]一種基于LC-MS高通量高靈敏度檢測(cè)植物激素的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010184072.1
• 申請(qǐng)日: 2020-03-16
• 公開（公告）號(hào): CN111308006B
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 籍淑賢;楊超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海中科新生命生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/89
• 分類號(hào): G01N30/89;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/34;G01N30/72
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 肖平安

1.一種基于LC-MS高通量高靈敏度檢測(cè)植物激素的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟S1：配制同位素內(nèi)標(biāo)品植物激素混合溶液，分別稱取各種同位素內(nèi)標(biāo)品植物激素，包括：D-tZ、D-tZR、D-iPR、D-iP、D-BL、D-ABA、D-SA、D-ACC、D-DHZ、D-GA1、D-GA4和D-CS，分別加入甲醇溶液溶解制成質(zhì)量濃度相同的12種同位素內(nèi)標(biāo)品植物激素母液，取相同體積的各種同位素內(nèi)標(biāo)品植物激素母液混合均勻，并用50％的甲醇水溶液稀釋，制成200ng/mL的同位素內(nèi)標(biāo)品植物激素混合溶液，備用；

步驟S2：配制標(biāo)準(zhǔn)品植物激素溶液，分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品植物激素，再分別加入甲醇溶液溶解制成質(zhì)量濃度相同的標(biāo)準(zhǔn)品植物激素母液，取相同體積的各種標(biāo)準(zhǔn)品植物激素母液混合均勻，并用50％的甲醇水溶液稀釋，制成1000ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品植物激素溶液，備用；所述的標(biāo)準(zhǔn)品植物激素溶液包括：吲哚乙酸IAA、反式玉米素tZ、順式玉米素cZ、反式玉米素核苷tZR、順式玉米素核苷cZR、異戊烯腺嘌呤核苷iPR、異戊烯基腺嘌呤iP、赤霉素GA3、茉莉酸JA、油菜素內(nèi)酯BL、脫落酸ABA、水楊酸SA、1-氨基環(huán)丙烷羧酸ACC、二氫玉米素DHZ、赤霉素1GA1、赤霉素7GA7、赤霉素4GA4、茉莉酸異亮氨酸JA-Ile、12-氧-植物二烯酸cis-OPDA、油菜素甾酮CS和香蒲甾醇TY；

步驟S3：構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，用50％甲醇水溶液將步驟S2制得的標(biāo)準(zhǔn)品植物激素溶液分梯度稀釋至1ng/mL，每梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品植物激素溶液取50μL并分別加入10μL步驟S1制得的同位素內(nèi)標(biāo)品植物激素混合溶液，混合均勻，再分別加入940μL甲醇/乙腈/水混合液，混合均勻，靜置12-24小時(shí)，再離心取上清液置于Ostro 25mg 96孔板中過濾，濾液用氮?dú)獯蹈桑儆?00μL的50％乙腈溶液復(fù)溶，離心，取上清液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；

步驟S4：樣品分析，取植物組織樣本，加入10μL步驟S1制得的同位素內(nèi)標(biāo)品植物激素混合溶液，混合均勻，再加入990μL甲醇/乙腈/水混合液，混合均勻，靜置12-24小時(shí)，再離心取上清液置于Ostro 25mg 96孔板中過濾，濾液用氮?dú)獯蹈桑儆?00μL的50％乙腈溶液復(fù)溶，離心，取上清液進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，將分析結(jié)果使用構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出對(duì)應(yīng)的植物激素濃度；

步驟S3和S4中的液相色譜的洗脫方式是流動(dòng)相A：0.05％甲酸水溶液；流動(dòng)相B：0.05％甲酸的乙腈溶液；色譜柱型號(hào)：BEH C18 1.7μm,2.1mm×100mm；流速為400μL/min，柱溫為50℃，進(jìn)樣量為4μL，流動(dòng)相A和B的配比如下表：

時(shí)間(min)	％A	％B
0	98	2
0.5	98	2
1	90	10
5	80	20
10	30	70
10.2	5	95
11	5	95
11.1	98	2
13	98	2

洗脫時(shí)間為13min；

步驟S3和S4中的質(zhì)譜分析條件如下：

采用電噴霧電離正負(fù)離子同時(shí)掃描檢測(cè)模式和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的質(zhì)譜掃描模式；

正離子掃描模式條件如下：離子源溫度：550℃，霧化氣壓：55，輔助氣壓：50，氣簾氣：30，噴霧電壓：4500V；正離子模式對(duì)應(yīng)的植物激素包括：反式玉米素tZ、順式玉米素cZ、二氫玉米素DHZ、反式玉米素核苷tZR、異戊烯腺嘌呤核苷iPR、異戊烯基腺嘌呤iP、油菜素內(nèi)酯BL、油菜素甾酮CS、香蒲甾醇TY、1-氨基環(huán)丙烷羧酸ACC、吲哚乙酸IAA和順式玉米素核苷cZR；

負(fù)離子掃描模式條件如下：離子源溫度550℃，霧化氣壓：55，輔助氣壓：50，氣簾氣壓：30，噴霧電壓：-4500V；負(fù)離子模式對(duì)應(yīng)的植物激素包括：赤霉素GA3、茉莉酸JA、脫落酸ABA、水楊酸SA、赤霉素1GA1、赤霉素7GA7、赤霉素4GA4、茉莉酸異亮氨酸JA-Ile和12-氧-植物二烯酸cis-OPDA。