[發(fā)明專利]靶向RNA的6-甲基腺嘌呤修飾CasRx載體系統(tǒng)及制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010184015.3
• 申請(qǐng)日: 2020-03-16
• 公開（公告）號(hào): CN111440826A
• 公開（公告）日: 2020-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 紀(jì)衛(wèi)東;應(yīng)小玲;張海青
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 廣州厚海專利商標(biāo)代理事務(wù)所(普通合伙) 44662
• 代理人: 梁桂萍

本發(fā)明涉及一種RNA編輯技術(shù)領(lǐng)域，尤指一種靶向RNA的6?甲基腺嘌呤修飾CasRx載體系統(tǒng)及制備方法和應(yīng)用，所述的載體系統(tǒng)包括失活的CasRx核酸酶融合6?甲基腺嘌呤修飾酶的酶活性功能區(qū)的蛋白表達(dá)載體、寡核苷酸，以及包括啟動(dòng)子序列、基于靶點(diǎn)序列的gRNA、gRNA支架序列和酶切位點(diǎn)序列的表達(dá)載體；本發(fā)明采用的載體系統(tǒng)可以對(duì)RNA修飾異常引起的疾病進(jìn)行靶向修飾6?甲基腺嘌呤，準(zhǔn)確而高效，可以從根本上治療RNA修飾缺陷引起的疾病。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種RNA編輯技術(shù)領(lǐng)域，尤指一種靶向RNA的6-甲基腺嘌呤修飾CasRx載體系統(tǒng)及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

腺嘌呤6-甲基化(即m⁶A)是mRNA和長鏈非編碼RNA中最為常見的修飾，研究證實(shí)m⁶A修飾發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，由甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14、結(jié)合亞基WTAP及RBM15(m⁶A‘Writer’，m⁶A編碼器)和去甲基轉(zhuǎn)移酶FTO、ALKBH5(m⁶A‘Eraser’，m⁶A消碼器)動(dòng)態(tài)催化調(diào)節(jié)。m⁶A可以通過結(jié)合YTH結(jié)構(gòu)域蛋白(m⁶A‘Writer’，m⁶A讀碼器)發(fā)揮其生物學(xué)作用。

CDCP1是一種重要的跨膜蛋白，由836個(gè)氨基酸組成，包括一個(gè)含29個(gè)氨基酸殘基的氨基端信號(hào)膚及分別由636、21、150個(gè)氨基酸組成的胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段。研究證實(shí)CDCP1作為Src、EGFR、HER2等信號(hào)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)促癌基因CDCP1的3'UTR存在m⁶A甲基化修飾。

近兩年，靶向RNA的Cas13酶成為關(guān)注的熱點(diǎn)，與RNA干擾類似，Cas13酶能夠敲低RNA而不改變基因組，同時(shí)具有更高靶向特異性。最近，兩個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)了一種新的Cas13d酶，它中位大小只有2.8kb，可以輕松包裝到容量有限的載體中。為了鑒定Cas13d酶，Salk生物研究所和Arbor Biotechnologies公司的研究人員通過常用的生物信息學(xué)篩選，在推定的效應(yīng)核酸酶附近尋找CRISPR重復(fù)序列。他們鑒定出的Cas13d蛋白與之前發(fā)現(xiàn)的Cas13a-c同源物的序列相似度不高，但含有Cas13超家族特有的HEPN核酸結(jié)構(gòu)域。ArborBiotechnologies公司的Yan等人研究了來自惰性真桿菌的EsCas13d和瘤胃球菌屬的RspCas13d，而Salk研究所的Konermann等人鑒定了來自厭氧消化宏基因組的AdmCas13d、黃色瘤胃球菌的CasRx以及EsCas13d。與其他Cas13酶一樣，這些Cas13d同源物能獨(dú)立地將CRISPR序列加工成向?qū)NA。它們依賴crRNA來切割目標(biāo)，而不依賴HEPN結(jié)構(gòu)域。這些酶對(duì)目標(biāo)的側(cè)翼序列沒有要求，因此可以靶向任何RNA序列。Hsu團(tuán)隊(duì)意識(shí)到就像Cas9家族一樣，源自不同細(xì)菌種類的Cas13d酶在它們的活性也會(huì)有所不同，因此他們進(jìn)行篩選，以便鑒定出一種可在人細(xì)胞中使用的最佳Cas13d類型。他們發(fā)現(xiàn)這種最佳類型來自一種腸道細(xì)菌：黃化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)XPD3002，故命名為CasRx。Salk研究所的Konermann等人則發(fā)現(xiàn)，與核定位信號(hào)(NLS)融合的CasRx和AdmCas13d能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中很好地發(fā)揮功能。由于催化失活的dCasRx保留了RNA結(jié)合特性，Konermann等人分析了它選擇性剪接RNA的能力。他們以編碼癡呆相關(guān)tau蛋白的MAPT基因?yàn)檠芯繉?duì)象，導(dǎo)入dCasRx以實(shí)現(xiàn)選擇性剪接。通過AAV載體導(dǎo)入iPS衍生的皮質(zhì)神經(jīng)元之后，dCasRx介導(dǎo)選擇性剪接，引起外顯子跳躍，可迅速調(diào)整了致病性與非致病性tau蛋白的比例，展示了dCasRx的臨床應(yīng)用前景。與靶向RNA的其他技術(shù)相比，CasRx因具有較小的分子量(這使得很容易將它包裝到治療上相關(guān)的病毒載體中)和較高的效率而具有獨(dú)特性，而且與RNA干擾相比，不產(chǎn)生明顯的脫靶效應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容