[發明專利]一種DNA雙鏈標記化合物及其確定化合物結合靶標蛋白的方法

在審

• 申請號: 202010179918.2
• 申請日: 2020-03-20
• 公開（公告）號: CN111718930A
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 李進;鞏曉明;張毅;陳秋霞;竇登峰;劉觀賽;王釗;萬金橋;李萍;羅華東
• 申請（專利權）人: 成都先導藥物開發股份有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;G01N27/62
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種DNA雙鏈標記化合物，其特征在于：它具有式I所示的通式：

生物素—DNA—X

式I

其中，

X為工具化合物；

DNA雙鏈中包含限制性內切酶識別序列。

2.根據權利要求1所述的DNA雙鏈標記化合物，其特征在于：式I中DNA雙鏈的長度為10～100bp；優選地，所述雙鏈的長度為10～50bp。

3.根據權利要求1所述的DNA雙鏈標記化合物，其特征在于：DNA雙鏈中限制性內切酶識別序列在X端的0～30bp之內。

4.根據權利要求1所述的DNA雙鏈標記化合物，其特征在于：限制性內切酶識別序列為黏性末端限制性內切酶識別序列或平端限制性內切酶識別序列。

5.根據權利要求4所述的DNA雙鏈標記化合物，其特征在于：限制性內切酶識別序列為EcoR1、Hind III、BamH I、Sal I、Bal I、Hae III、Sma I序列。

6.根據權利要求1所述的DNA雙鏈標記化合物，其特征在于：式I中生物素和DNA雙鏈之間通過連接基團共價連接。

7.根據權利要求6所述的DNA雙鏈標記化合物，其特征在于：式I中生物素通過生物素化-尿嘧啶核苷三磷酸引入至DNA雙鏈的末端。

8.根據權利要求1所述的DNA雙鏈標記化合物，其特征在于：式I中DNA與X之間通過連接基團共價連接。

9.根據權利要求8所述的DNA雙鏈標記化合物，其特征在于：式I中DNA與X之間共價連接的連接基團為：

10.根據權利要求1所述的DNA雙鏈標記化合物，其特征在于：X的分子量為100～4000Da。

11.一種利用式I的DNA雙鏈標記化合物，確定化合物結合蛋白靶標的方法，包括以下步驟：

a.利用反復凍融法溫和裂解細胞獲得細胞總蛋白；

b.在細胞裂解液中加入DNA雙鏈標記化合物進行孵育；

c.加入鏈霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠進行孵育；

d.通過離心或磁體分離出靶標蛋白-DNA雙鏈標記化合物-鏈霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠的復合物；

e.加入特定的限制性內切酶，使鏈霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠-DNA的復合物部分被切除；

f.通過離心或磁體分離，得到上清液；

g.從上清液中確定潛在的靶標蛋白質；

h.通過潛在靶標蛋白質與化合物的親和力驗證，確認靶標蛋白。

12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于：步驟a中反復凍融法為：將細胞懸于HBSS緩沖液中離心，棄上清，加入少量HBSS緩沖液將細胞重懸于離心管中，放置于液氮速凍，待樣品完全冰凍后再放至冰上環緩慢融化，反復操作三次。

13.根據權利要求11所述的方法，其特征在于：步驟b中加入的DNA雙鏈標記化合物的濃度為0.1～10μM，孵育條件為4℃低速搖床孵育1小時至過夜。

14.根據權利要求11所述的方法，其特征在于：步驟c中加入鏈霉素或中性抗生物素蛋白包被磁珠的量滿足其可結合生物素的摩爾數大于反應體系中化合物總摩爾數的三倍，孵育條件為4℃低速搖床孵育1小時至過夜。

15.根據權利要求11所述的方法，其特征在于：步驟d中分離前加入10倍體積的HBSS溶液，并重復3～5次離心或磁體分離，以除去未結合蛋白。

16.根據權利要求11所述的方法，其特征在于：在步驟d之后重懸分離進一步洗去未結合蛋白。