[發明專利]一種瘧原蟲檢測的熒光染色方法

有效

• 申請號: 202010179705.X
• 申請日: 2020-03-16
• 公開（公告）號: CN113406045B
• 公開（公告）日: 2022-11-04
• 發明（設計）人: 王海;鄭南才
• 申請（專利權）人: 廣州創瑞健康科技有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 廣州藍晟專利代理事務所(普通合伙) 44452
• 代理人: 歐陽凱;梁悄

本發明涉及一種用于瘧原蟲檢測的熒光染色方法及其試劑。其方法特征在于通過分子垂釣實驗獲得能夠與瘧原蟲核結構特異性結合的小分子化合物，對其進行修飾和標記，形成特異性熒光素標記小分子；使用本發明所提供的試劑，實現對血液中瘧原蟲進行熒光染色檢測；試劑與樣本混合后，特異性熒光素標記小分子同瘧原蟲結合，在熒光顯微鏡下使含有瘧原蟲的血紅細胞呈現亮色或特異性顏色，其他血細胞為黑色或背景色。

技術領域

本發明涉及一種以熒光素為標記物的快速檢測方法及可檢測瘧原蟲的熒光染色試劑，涉及的瘧原蟲為感染人的五種瘧原蟲，涉及的瘧原蟲包括惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、巴西瘧原蟲，可用于生物學、醫學檢驗的相關領域。

背景技術

熒光染色方法是利用熒光素的光學特性，通過特殊波長的激發光激發下發射出特定顏色的波長，利用顯微鏡進行待檢物質觀察的一種方法。熒光染色方法包含非特異性熒光染色試劑和特異性熒光染色試劑。

非特異性熒光染色試劑一般采用非特異性熒光燃料，包含金胺O熒光染液等，該類試劑能夠對某一種生物大分子進行染色，而不能對含有這一種生物大分子的細胞、病毒、細菌等進行區分。

特異性熒光染色試劑采用能夠與待檢物特異結合的分子為主要核心原料，這些分子與待檢物的特殊結構具有抗原抗體或受體配體特異結合的特性。特異性熒光染色試劑對這些分子進行修飾和熒光素標記，具有檢測的特異性。

瘧疾是由瘧原蟲所致的蟲媒傳染病。瘧原蟲是一類單細胞、寄生性的原生動物，有五種瘧原蟲會使人類感染瘧疾，包括惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、間日瘧原蟲及諾氏瘧原蟲。瘧疾流行于102個國家和地區，據世界衛生組織估計，有20億人口居住在流行區，特別是在非洲、東南亞和中、南美洲的一些國家。瘧疾目前仍是公眾健康所面臨的最嚴重威脅之一。據世界衛生組織報告，全球大約40％的人口受瘧疾威脅，每年約有3億人感染瘧疾，110萬人因瘧疾死亡，90％為兒童。

引起瘧疾的病原是瘧原蟲生活史中紅細胞內無性增殖期的裂殖體。當成熟裂殖體脹破紅細胞時，釋放出裂殖子、瘧原蟲的代謝產物，以及紅細胞碎片等一起進入血流。其中相當一部分物質被巨噬細胞及多形核細胞吞噬，刺激這些細胞產生內源性熱原質，后者和瘧原蟲代謝物共同作用于下丘腦的體溫調節中樞，引起發熱。

瘧疾的發作，是達到一定數量的紅細胞內無性期(裂體增殖期)瘧原蟲對機體的刺激引起的。瘧疾發作周期和紅內期裂體增殖周期一致，因此，間日瘧為隔日發作一次，惡性瘧初期發作通常隔日一次，其后則發作不規則。間日瘧有復發現象，即瘧疾初發后紅細胞內期瘧原蟲已被消滅，經數月至年余，未經蚊媒叮咬，仍又出現瘧疾發作。這是由于瘧原蟲在肝細胞內發育存在休眠子。

從人體感染瘧原蟲到發病，稱為潛伏期。間日瘧潛伏期一般為13-15天，亦可達6個月以上，亦見長達一年者。多有前驅期。臨床急性發作以體溫超過37.8℃為準，發熱始于中午前后和晚上9點以前，偶見于深夜。開始一、二次癥狀較輕，熱度較低，隨后日益加重。惡性瘧潛伏期一般為6～27天，平均11天，多突然發病，無寒戰，僅有畏寒感。高熱者多見，熱型復雜，有的像間日瘧，隔天發作1次；有的每天發熱，熱型呈間歇型、弛張型或不規則型；有的持續高熱，發熱期往往長達20～36h；前后兩次發作的間歇期極短。卵形癥與間日瘧相似。三日瘧潛伏期18～35天，平均28天。

瘧疾的實驗室檢測技術包括鏡檢法、免疫學檢測瘧原蟲抗原、PCR檢測、Dipstick方法。鏡檢法包括普通染色鏡檢法、吖啶橙染色鏡檢法、核酸探針檢測。

普通染色鏡檢法采用吉氏染色液染色后鏡檢，是瘧原蟲檢測的金標準，但受制于血中瘧原蟲密度、制片和染色技術、服藥后瘧原蟲變形以及鏡檢經驗等因素的影響；

吖啶橙染色鏡檢法采用吖啶橙代替吉氏染色液，缺點在于吖啶橙為非特異性核酸燃料，對于紅細胞內寄生的其他病原體、正常人血液中少量的幼稚紅細胞、白細胞可以著色而無法鑒別。