[發明專利]表達豬CD163和CD169分子的懸浮Marc145細胞系

在審

• 申請號: 202010179681.8
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111394315A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 方華明;張冬冬;歐仁芳;劉小方;潘倩
• 申請（專利權）人: 成都天邦生物制品有限公司;史記生物技術(南京)有限公司;馬鞍山史記動物健康管理有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/12;C12N5/02;C12N7/00;C12R1/91
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種表達豬CD163和CD169、且能在無血清培養基中懸浮培養的Marc145細胞系的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)重組質粒構建：將CD169基因連接到PB513B載體上，得PB513B-CD169質粒，再將CD163基因連接到PB513B-CD169質粒上，得PB513B-CD169-CD163質粒；

2)轉染Marc145細胞：使用脂質體3000轉染試劑將PB513B-CD163-CD169質粒與轉座酶質粒一起轉染到Marc145細胞內，在含有10％(v/v)的胎牛血清的DMEM培養基培養；

3)嘌呤霉素篩選：用含有嘌呤霉素和10％(v/v)胎牛血清DMEM培養基篩選轉基因細胞；

4)培養馴化：將轉基因細胞進行傳代培養，培養基中的胎牛血清濃度逐代降低，并最終使用無血清培養基進行懸浮培養。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

步驟3)具體是用含有2μg/mL嘌呤霉素和10％(v/v)胎牛血清DMEM培養基篩選轉基因細胞；

和/或，步驟4)中的培養馴化方法是：首先在含10％(v/v)胎牛血清的MEM培養基培養兩代，再換到含5％胎牛血清的BD004培養基中培養一代，再換到含2％胎牛血清的BD004培養基中培養一代，再用胰酶消化Marc145細胞使脫離培養皿，轉移到CD Marc145 259無血清懸浮培養基懸浮培養2代以上。

3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

步驟1)中CD163基因是使用序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物擴增cDNA，得到產物后，再用序列如SEQ ID NO.7～8所示的引物擴增得到；

所述cDNA是由豬肺泡巨噬細胞總RNA反轉錄得到的。

4.權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

步驟1)中CD169基因是使用序列如SEQ ID NO.3～4所示的引物擴增cDNA，得到產物后，再用序列如SEQ ID NO.5～6所示的引物擴增得到；

所述cDNA是由豬肺泡巨噬細胞總RNA反轉錄得到的。

5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

步驟1)中CD169被連接在PB513B載體的XbalI和BamHI限制性酶切位點之間。

6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

步驟1)中CD163被連接在PB513B載體的NotI限制性酶切位點處。

7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述轉座酶質粒是PiggyBacSuperTransposase。

8.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于：

步驟2)中PB513B-CD163-CD169質粒與轉座酶質粒的質量比是2：1。

9.權利要求1～8任一所述方法制備得到的細胞系。

10.權利要求9所述細胞系在培養豬繁殖與呼吸綜合征病毒中的用途。