[發明專利]一種高產9-OHAD的分枝桿菌及其構建的方法

在審

• 申請號: 202010178401.1
• 申請日: 2020-03-14
• 公開（公告）號: CN111484964A
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 宋浩;孫鴻
• 申請（專利權）人: 天津大學青島海洋技術研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/74;C12R1/32
• 代理公司: 北京開林佰興專利代理事務所(普通合伙) 11692
• 代理人: 劉帥帥

本發明公開了一種高產9?OHAD的分枝桿菌及其構建的方法，其特征在于，包括下列步驟：（一）RNA提取和RT?qPCR分析；（二）敲除kstd菌株的構建；（三）甾醇代謝相關基因表達載體的構建；（四）分枝桿菌電轉化；（五）樣品的提取、檢測與定量。本發明首次提出模塊化改造分枝桿菌構建高產9?OHAD菌種，并鑒定了多個基因與9?OHAD積累的關系。通過在分枝桿菌中過表達3β?HSD，5α?reductase和KSH基因，同時敲除kstd基因，從而提高9?OHAD的產量，為將來的工業化生產提供理論依據。

技術領域：

本發明涉及一種高產9-OHAD的分枝桿菌及其構建的方法，屬于生物基因工程領域。

背景技術：

甾體是廣泛存在于自然界中的一類天然化學成分，隨著越來越多疾病的出現，甾體激素類藥物已逐漸發展成為醫藥領域的重要門類。放線菌在利用與代謝異型生物質時表現出區別于其他類菌種的天然優勢，在某些情況下，甾醇也可作為微生物的碳和能量來源。分枝桿菌就可以利用天然甾醇或一些其他甾體化合物作為唯一的碳和能源。分枝桿菌分解代謝途徑的中斷導致一些重要中間體的過度積累，如AD和9-OHAD，可用作生產甾體激素藥物的前體。

隨著甾體降解基因簇的揭示，其中關鍵酶的功能被逐一鑒定，人們已經成功的將基因簇的絕大部分基因與甾類代謝通路準確關聯，準確的闡釋了多步降解反應的發生機制。研究表明，一個甾體分子徹底降解為小分子能量物質的過程共四步：甾醇分子的攝取；甾核的開環反應；開環甾核的降解；側鏈基團的氧化。研究認為，放線菌攝取環境中甾類物質的主要方式是生物接觸，它們可以通過產生和分泌一些特殊的表面活性劑，增進疏水性甾醇分子進入細胞膜磷脂層的效率。此外，胞外存在的膽固醇氧化酶或脫氫酶也是有利于甾醇轉運的積極因素之一。甾醇的支鏈降解是個類似脂肪酸β-氧化的過程，以1單位β-谷留醇為準，在其降解至中間物9-OHAD時，共經歷十幾步酶促反應，可產生3單位丙酰CoA以及1單位乙酰CoA。一些重要的實驗發現，細胞色素P450 cyp125基因參與了類固醇C26羧酸的形成，該基因的缺失將導致4-膽甾烯-3-酮(cholest-4-en-3-one)的積累，不能繼續轉化膽固醇的側鏈；FadA5是分枝桿菌基因簇中的硫解酶，屬于酞基CoA轉移酶家族，當FadA5敲除時，硫解反應即出現被完全阻斷的跡象，可推測FadA5為作用C24-C22硫解反應的關鍵因子；Thomas等人證實結核桿菌H37Rv中，位于igr操縱子內的fadE28-29是編碼C22-酮基中間體化合物脫氫酶的關鍵基因，是結核分枝桿菌利用膽固醇的關鍵因子。Van der Geize等人通過鑒定Rhodococcus sp.RHA1的轉錄組，發現其中與側鏈β-氧化有關的一組基因(hsd4A，hsd4B，fadD19，fadE26，ltp3)顯著上調。研究發現紅球菌DSM43269中fadD19基因編碼中的一種輔酶連接酶，參與側鏈β-氧化。甾類物質的代謝同時開始于甾核的開環與側鏈的末端氧化，而甾核的開環反應則開始于膽固醇氧化酶(或脫氫酶)的作用，其次是接連發生的脫氫和羥基化反應。甾核上的第一步反應是將膽甾-5-烯-3-醇氧化為膽甾-4-烯-3-酮的變化實質包括膽甾-5-烯-3-醇的生成與自身異構化為膽甾-4-烯-3-酮兩個過程。此過程需要膽固醇氧化酶(Cho)和3β-羥基甾體脫氫酶/異構酶(3β-HSD)的參與。經過膽固醇氧化酶(Cho)和3β-羥基甾體脫氫酶/異構酶(3β-HSD)的催化后，甾醇氧化為4-烯-3-酮結構的甾酮，由此開始甾環的降解，包括3-甾酮-脫氫酶(KstD)與3-甾酮-9α-脫氫酶(KSH)的作用，形成9α-羥基-1,4-二烯甾體(9-OHADD)的不穩定結構，在無酶催化下就會發生甾核的開環。如上所述，9-OHAD的積累受到三個模塊的影響(甾醇分子的攝取；側鏈基團的氧化；甾核的開環反應)，以前的研究主要集中在甾核的開環反應，即3-甾體-9a-羥化酶(KSH)的過表達和3-甾體-D1-脫氫酶的敲除(KstD)，對于甾醇分子的攝取和側鏈基團的氧化的研究相對較少。最近，已經發表了對涉及分枝桿菌細胞的類固醇分解代謝的酶進行了代謝工程的成功研究。Yao等在敲除KSTD增強KSH活性后，新菌種在144小時內從15g/L植物甾醇的轉化產生7.33g/L 9α-羥基-4-雄甾烯-3,17-二酮(9-OHAD)。