[發明專利]一種適冷的I型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因

有效

• 申請號: 202010178189.9
• 申請日: 2020-03-14
• 公開（公告）號: CN111197052B
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 吳高兵;郭亮;吳方;阮麗芳;劉子鐸
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 張紅兵

本發明屬于微生物基因工程技術領域，具體涉及一種適冷的I型5?烯醇丙酮酰莽草酸?3?磷酸合酶基因。所述的I型5?烯醇丙酮莽草酸?3?磷酸合酶(EPSPS)基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，該基因編碼的蛋白質序列如SEQ ID NO：2所述。所述適冷的I型5?烯醇丙酮莽草酸?3?磷酸合酶基因是根據Genbank中報導的同屬嗜鹽白蟻菌Isoptericola sp.GR1TH_0001的aroA基因保守序列克隆得到的，經過生物學試驗驗證，證明該酶對草甘膦具有較高的耐受性，且具有獨特的低溫適應性。

技術領域

本發明屬于微生物基因工程技術領域，具體涉及一種分離的適冷的I型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因。本發明對來源于微生物對草甘膦具有抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的進行了分離與抗性鑒定，證明本發明克隆的基因編碼的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的核苷酸序列對草甘膦具有較高的抗性，含有該基因的大腸桿菌細胞能夠耐受濃度為200mM/L的草甘膦。同時，該酶在10℃下仍具有較高的活性，該酶是首個鑒定的具有低溫適應性且抗草甘膦的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，其編碼基因在培育越冬抗除草劑作物方面具有極大的應用潛力。

背景技術

雜草一直是干擾作物栽培產量的主要問題，人工成本的攀升使得人工除草日益被化學除草劑滅殺所替代。

草甘膦(glyphosate，中文名稱：農達)是目前全球生產、使用最為廣泛的廣譜除草劑，對大多數植物具有滅生性。

莽草酸途徑是連接碳水化合物和芳香族化合物生物合成的重要生物代謝途徑。該途徑只存在于細菌、真菌、藻類、和植物中^[1-3]。5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)是莽草酸途徑中第六步的關鍵酶，催化底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和莽草酸-3-磷酸(S3P)生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸^[4]。草甘膦與EPSPS的作用底物之一PEP的過渡態具有類似的結構，因此具有競爭性地抑制EPSPS的作用。草甘膦的作用機理是以競爭磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和非競爭莽草酸-3-磷酸(S3P)的方式同植物體內5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)結合，形成穩定的EPSPS-S3P-草甘膦復合物^[5]，引起EPSPS活性的喪失，大量碳源流向S3P造成莽草酸在組織中快速積累。另一方面，蛋白質生物合成所必需的芳香族氨基酸合成則嚴重受阻，最終導致植物生長受到抑制^[6]。

草甘膦及其衍生物能夠通過莽草酸代謝途徑殺死大多數植物或抑制大多數細菌生長。但在自然界中仍存在一些細菌的EPSPS酶能夠耐受較高濃度的草甘膦。通過轉化外源抗性基因到植物細胞，使植物對草甘膦獲得耐受性。早期研究根據EPSPS對草甘膦的敏感性分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型EPSPS對草甘膦敏感，大多數微生物和植物來源的EPSPS都屬于這一類，典型代表有大腸桿菌Escherichia coli、鼠傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium、煙草Nicotiana tabacum、擬南芥Arabidopsis thaliana等。Ⅱ型EPSPS對草甘膦具有天然抗性，與Ⅰ型同源性較低，典型代表有根癌農桿菌Agrobacterium sp.CP4、假單胞菌Pseudomonassp.PG2982和可變鹽單胞菌Haloviborio variabilis等。目前廣泛應用于轉基因草甘膦作物培育的基因主要為來源于根癌農桿菌Agrobacterium sp.CP4的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(CP4-EPSPS)編碼基因，該酶雖對草甘膦具有很高的抗性，但低溫環境下，其活性較低，限制了其應用范圍。對于冬油菜、小麥等越冬作物，通過轉基因技術導入低溫下具備較高酶活性且耐受草甘膦的EPSPS酶編碼基因，可實現對草甘膦抗性，培育越冬作物抗草甘膦新品種。但從現有研究看，全球缺乏既具有高草甘膦抗性且具有低溫環境適應性EPSPS酶編碼基因。