[發明專利]用于檢測尿液中微量觸珠蛋白的化學發光試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202010178072.0
• 申請日: 2020-03-14
• 公開（公告）號: CN111323601A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 楊金奎;陳興;楊芳遠;楊艷慧
• 申請（專利權）人: 北京市糖尿病研究所;石家莊和亞生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/543;G01N21/76
• 代理公司: 石家莊冀科專利商標事務所有限公司 13108
• 代理人: 孟玉寒

一種用于檢測尿液中微量觸珠蛋白的化學發光試劑盒，所述化學發光試劑盒采用雙單抗夾心法檢測尿液中的微量觸珠蛋白，所述化學發光試劑盒包括化學發光板、酶標單抗溶液、標準品溶液和發光底物，所述化學發光板采用稀釋后的單克隆抗體5C4包被，并采用封閉液封閉，所述酶標單抗溶液包括由HRP標記的單克隆抗體HRP?1A2和抗體稀釋液，所述單克隆抗體5C4和單克隆抗體1A2為可識別人類天然Hp分子結構表位的單克隆抗體。本發明化學發光試劑采用雙單抗夾心法檢測尿液中Hp含量，利用單克隆抗體5C4和1A2作為雙單抗體，此對單克隆抗體可特異性識別人類Hp分子結構表位，結構表位抗體可特異性的檢測非變性的Hp分子，檢測準確度高，偏倚值為?6.78％～10.12％。

技術領域

本發明涉及一種用于檢測尿液中微量觸珠蛋白的化學發光試劑盒及方法，屬于生物醫藥診斷技術領域。

背景技術

觸珠蛋白(Haptoglobin,Hp)又稱結合珠蛋白，廣泛存在于人類和多種哺乳動物的血清及其他體液中。在CAM電泳及瓊脂糖凝膠電泳中，觸珠蛋白位于α2區帶，分子中有兩對肽鏈(α鏈與β鏈)共同形成α2β2的四聚體。Hp的分子結構受遺傳控制，人類存在兩種不同的等位基因Hp1和Hp2。因此，形成了三種Hp基因型：Hp1-1，Hp2-1和Hp2-2。

觸珠蛋白的主要功能是與游離血紅蛋白結合成復合物并通過與CD163分子結合提呈給單核-巨噬細胞系統處理，從而可以去除血液循環中的游離血紅蛋白，避免其對腎臟的損害。研究顯示不同基因型的Hp結合血紅蛋白的能力不同，其中以Hp1-1最強，Hp2-2最弱。Hp在臨床上常用于診斷血管內溶血性疾病，如陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥和蠶豆病，以及先天性無結合珠蛋白血癥等。同時，Hp還是一種急性時相蛋白，當機體處在應激狀態時，血液中的結合珠蛋白明顯增多，如心肌梗塞、腫瘤、炎癥、創傷、感染等病理狀態時，以及應用某些激素，如皮質激素和雄性激素后，其血清含量常有顯著升高，并與嚴重程度和預后有關。

近年來，隨著蛋白組學技術的廣泛應用，Hp更多的新功能被人們認識和發現。尤其是在糖尿病領域，研究發現Hp是糖尿病患者血管并發癥易感的決定因素之一，彌補了傳統預測因素無法早期預測遠期預后的不足。其中美國學者、新加坡學者和中國學者(北京同仁醫院楊金奎教授)三個獨立的研究團隊先后實驗證實尿液Hp濃度是2型糖尿病腎病敏感的早期標志物，其中楊金奎團隊率先證明了尿Hp與糖尿病視網膜微血管病變的關系，其研究內容為《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》所采納。因此尿Hp的檢測對糖尿病并發癥(視網膜病變和腎病)早期診斷和預防具有非常重要的意義。

目前，用于檢測血液Hp含量的測定試劑盒的檢測原理基于散射比濁法：血清中包含的Hp蛋白與試劑中的特異性抗體結合形成免疫復合物，這些免疫復合物會使穿過標本的光束發生散射，散射光的強度與血清中Hp濃度成正比，通過與已知的標準Hp濃度對比可計算出血清中Hp的含量。但是，由于受到散射比濁方法學的限制，雖利于自動化，但檢測靈敏度較差，只能檢測μg/mL級濃度水平的Hp，對于濃度低至ng/mL的尿液Hp無法完成精確分析。另一種可用于Hp含量分析的試劑為觸珠蛋白ELISA檢測試劑盒。該試劑盒采用單克隆抗體包被空白酶聯板，以辣根過氧化物酶(HRP)標記的多克隆抗體為檢測抗體，通過兩步法的方式檢測體液中的Hp濃度。此檢測法的操作簡便，無需復雜儀器，可穩定檢測濃度低至0.2ng/mL的Hp蛋白。但是，此檢測試劑也存在明顯的不足：⑴檢測效率低下，需要較長的檢測時間；⑵檢測抗體為多克隆抗體，穩定性差，導致不同批次的試劑檢測一致性較差；⑶與小鼠Hp有0.855％的非特異性交叉反應；⑷無法實現自動化檢測。尿液Hp濃度分析對糖尿病腎損傷早期診斷具有重要的意義，目前還不存在適合于臨床實驗室使用的用于檢測尿液低濃度Hp的自動化方法。

發明內容