[發明專利]一種骨關節炎關節液來源的間充質干細胞的培養方法

在審

• 申請號: 202010177736.1
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN112941021A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 黃勇;朱偉民;常崇斐;陳斐;劉雨微;楊遠;傅子財;謝都
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院(深圳市轉化醫學研究院)
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 深圳市合道英聯專利事務所(普通合伙) 44309
• 代理人: 廉紅果

1.一種骨關節炎關節液來源的間充質干細胞的培養方法，包括下述步驟：

(1)、關節液來源的間充質干細胞的提取擴增：將收集的從膝關節炎患者關節穿刺時抽取的關節液用孔徑為70um的細胞篩過濾，移至100mm培養皿中，加5ml含20％患者自體血清和1％青霉素和鏈霉素雙抗的α-MEM培養基，混勻后轉移至37℃5％CO₂培養箱培養，24h后去除表面培養基，再用PBS輕柔洗滌兩次，加入完全培養基，每周換液2次，每次換液先去除培養基，用PBS輕柔洗滌兩遍，再加入完全培養基；所述完全培養基組成為5％血清替代物、1％青霉素和鏈霉素雙抗和94％MSCBM培養基；

(2)、關節液來源的間充質的擴增：待局部細胞融合率達80％-90％即可傳代，去除表面培養基，再用PBS輕柔洗滌兩次，加入胰酶后置于37℃5％CO₂培養箱5min；在顯微鏡下觀察見貼壁細胞變為圓形，即可加入等量完全培養基終止消化，反復吹打，將細胞與培養皿表面完全分離；將混合液轉移至15ml離心管，用離心機于4℃1500rpm 3分鐘離心細胞。離心后去除細胞上清液，用完全培養基重懸細胞，置于培養皿內，將標記為P1代，于37℃5％CO₂培養箱繼續培養擴增，傳代至P3代即得間充質干細胞；所述完全培養基組成為5％血清替代物、1％青霉素和鏈霉素雙抗和94％MSCBM培養基。

2.權利要求1所述的培養方法，其特征在于，所述培養方法還包括采用流式細胞技術對步驟(2)所得P3代細胞進行表型鑒定的步驟。

3.根據權利要求2所述的培養方法，其特征在于，對P3代細胞進行表型鑒定的具體步驟為：P3代細胞生長融合達80％-90％后，棄細胞培養上清液，加入10mlPBS清洗一次，加入3mlTrypLE，于37℃5％CO₂培養箱消化5分鐘；待細胞消化懸浮于消化液后用移液管將細胞從培養皿上沖洗下來，再將消化液移至15ml離心管中，于4℃1500rpm 3分鐘離心細胞；離心后去除細胞上清液；用含0.1％BSA PBS重懸細胞，調整細胞濃度為10⁶個/ml；取100uL細胞懸液至1.5mlEP管中，保證每管細胞不小于10⁵個；將細胞懸液分別與20uLCD105、CD73、CD29、CD34、CD45、HLA-DR流式抗體混勻，在避光條件下置于4℃冰箱孵育30分鐘；4℃1500rpm 3分鐘離心細胞，去除細胞上清液，用含0.1％BSA PBS重懸細胞；反復清洗細胞三遍；清洗完后用含0.1％BSA PBS重懸細胞，移至流式管中，進行流式細胞檢測。