[發明專利]一種堿性磷酸酶的靈敏檢測方法

有效

• 申請號: 202010175831.8
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111239094B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發明（設計）人: 郭曉玉;郭壯壯;李金鴿;李廣寶;楊懷霞
• 申請（專利權）人: 河南中醫藥大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/38
• 代理公司: 鄭州中鼎萬策專利代理事務所(普通合伙) 41179
• 代理人: 徐文婷

本發明公開了一種堿性磷酸酶的靈敏檢測方法，技術方案是，利用ALP對于磷酸基團的特異性，與AAPi反應生成抗壞血酸AA，然后，AA與DES反應產生較強熒光，從而實現對ALP活性的測定。本發明采用4,4'?二疊氮二苯乙烯?2,2'?二磺酸二鈉四水合物(DES)作為熒光探針，具有成本低、檢測簡單、靈敏度高等優點。本發明的方法具有假信號少、靈敏度高、選擇性好、檢測快速等優點。實驗證明，本發明檢測線性范圍：5?40mU/mL，相關系數為0.998，檢出限1.46mU/mL，具有較高選擇性和抗干擾能力，為后期應用于臨床檢測奠定重要基礎。

技術領域

本發明涉及一種堿性磷酸酶的靈敏檢測方法，屬于生物分析技術領域。

背景技術

堿性磷酸酶(ALP)是一種廣泛存在于生物組織中的膜結合酶，由于生物體內ALP水平的異常往往與許多疾病密切相關，因此被廣泛用作臨床診斷的生物標志物。目前在明確催化機理的基礎上，研究人員建立了多種檢測堿性磷酸酶活性的方法，包括電化學法、熒光法、比色法和表面增強拉曼光譜法等。在上述方法中，光學方法，特別是熒光法，具有可靠、靈敏度高、使用方便、響應速度快、儀器要求低等優點，非常適合于高通量分析和實時檢測。通常，堿性磷酸酶的熒光檢測方法是通過比較酶底物和堿性磷酸酶觸發的水解產物的熒光響應來實現的。例如，利用ALP產物的熒光猝滅能力和Cu²⁺對焦磷酸鹽和磷酸鹽的區分能力，設計了許多熒光傳感器。但這樣的模式存在低信號輸出高的檢測背景以及相對較低的靈敏度和選擇性等不足。

相比之下，熒光開關法由于具有假信號少、選擇性好、靈敏度高等優點而備受關注。抗壞血酸2-磷酸(AAPi)是堿性磷酸酶(ALP)活性測定中最常用的特異性底物之一，在ALP存在下，AAPi可以水解并轉化為抗壞血酸(AA)。與AAPi相比，酶產物AA表現出更強的還原能力，在堿性條件下更容易脫氫。利用堿性磷酸酶(ALP)對AAPi的催化水解作用和AA的還原能力，構建新興的堿性磷酸酶熒光分析方法具有重要意義。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種簡便、靈敏、快速的檢測堿性磷酸酶活性的熒光方法。

為了實現上述目的，本發明的技術方案是提供：一種堿性磷酸酶的靈敏檢測方法，包括以下步驟：

(1)將AAPi溶液分別和一系列活性濃度梯度的ALP溶液混合，反應；

(2)在步驟(1)的反應液中分別加入DES溶液，反應；

(3)對步驟(2)的反應液分別進行熒光測定，構建ALP活性濃度和熒光強度的線性關系；

(4)利用線性關系，得到待檢測ALP溶液活性濃度。

AAPi溶液的濃度為0.1M。

一系列活性濃度梯度的ALP溶液的活性濃度為：5、10、20、30、40mU/mL。

ALP溶液為ALP的Tris Buffer溶液，Tris Buffer溶液的濃度為0.1M，含2mMMgCl₂，0.2mM ZnCl₂，pH＝8.0。

DES溶液的濃度為15mM。

AAPi溶液、ALP溶液、DES溶液的體積比為1：4：4。

步驟(1)中反應溫度為37℃，時間為50min。

步驟(2)中反應溫度為37℃，時間為30min。

熒光測定的條件為激發波長383nm，狹縫2nm。

本發明的有益效果：

1、設計一種基于抗壞血酸2-磷酸(AAPi)的熒光開關法ALP檢測方法，具有假信號少、靈敏度高、選擇性好、檢測快速等優點。