[發明專利]一種以納米顆粒作為參照物質的病毒顆粒的電鏡定量檢測方法

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• 申請號: 202010175825.2
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111257361A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 李智;李育修
• 申請（專利權）人: 蘇州智享眾創孵化管理有限公司
• 主分類號: G01N23/2251
• 分類號: G01N23/2251;G01N23/2202
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 李寶碩

1.一種以納米顆粒作為參照物質的病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將含有病毒顆粒的細胞收獲液和含有直徑為20-200nm納米顆粒的DMEM培養基混合；然后超高速離心處理，收集病毒顆粒；

(2)將收集到的病毒顆粒重新懸浮到DMEM培養基中，然后加入等體積的瓊脂；待其凝結成塊后，脫水包埋，最后切成0.1μm的超薄切片作為樣品，放在電鏡下觀察10個面積為1369μm²的病毒顆粒數與納米顆粒數，根據觀察到的病毒顆粒數、納米顆粒數來計算電鏡樣品中的納米顆粒濃度；進而推算出參照物質中納米顆粒的濃度，最后計算出細胞收獲液中的病毒顆粒濃度。

2.根據權利要求1所述的一種以納米顆粒作為參照物質的病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，其特征在于：步驟(1)中，所述含有病毒顆粒的細胞收獲液與含有直徑為20nm納米顆粒的DMEM培養基的體積比為1:1。

3.根據權利要求1所述的一種以納米顆粒作為參照物質的病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，其特征在于：步驟(1)中，含有納米顆粒的DMEM培養基中納米顆粒的濃度為5×10⁷個/ml，所述瓊脂的濃度為3-5％。

4.根據權利要求1所述的一種以納米顆粒作為參照物質的病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，其特征在于：步驟(1)中，所述超高速離心時的離心力為11000×g。

5.根據權利要求1所述的一種以納米顆粒作為參照物質的病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，其特征在于：步驟(1)中，超高速離心離心處理后收集的上清液采用0.45μm孔徑的過濾膜過濾后，重新在100000×g的離心力下進行超高速離心處理，合并兩次超高速離心收集的病毒顆粒。

6.根據權利要求1所述的一種以納米顆粒作為參照物質的病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，其特征在于：步驟(2)中，將重新懸浮病毒顆粒的DMEM與4％瓊脂混合凝結成塊后，加入前固定液進行固定處理3.5～4.5h。

7.根據權利要求6所述的一種以納米顆粒作為參照物質的病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，其特征在于：所述前固定液為戊二醛、多聚甲醛和次甲砷酸鈉組成的緩沖溶液，其中，所述戊二醛的質量濃度為2.5％、多聚甲醛的質量濃度為1％、次甲砷酸鈉的濃度為0.1mol/L的緩沖液的混合物；所述前固定液的pH為7.2～7.4。

8.根據權利要求7所述的一種以納米顆粒作為參照物質的病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，其特征在于：采用前固定液固定結束后采用0.1mol/L甲次砷酸鹽鈉緩沖液清洗，之后采用后固定液再次固定處理1～3h，所述后固定液由四氧化鋨和次甲砷酸鈉組成的緩沖液，所述后固定液中，四氧化鋨的質量濃度為1％，次甲砷酸鈉的濃度為0.1mol/L，所述后固定液的pH為7.2～7.4。

9.根據權利要求8所述的一種以納米顆粒作為參照物質的病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，其特征在于：采用后固定液處理后的樣品采用去離子水洗滌后，依次采用乙醇溶液、環氧丙烷溶液、包埋劑溶液處理，之后在55～65℃下固化處理15～17h，然后切成0.1μm的超薄切片，再采用醋酸鈾和檸檬酸鉛進行染色后再在電鏡下觀察。

10.根據權利要求9所述的一種以納米顆粒作為參照物質的病毒顆粒的電鏡定量檢測方法，其特征在于：所述包埋劑溶液中的包埋劑為EMbed-812樹脂、DDSA、NMA、DMP-30的混合物。