[發明專利]一種具低泄露率、表面可連接大腸桿菌抗體的復合磷脂脂質體及其應用

在審

• 申請號: 202010175726.4
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111289743A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 陳軍;顧薇;湯清涵;丁曉桐
• 申請（專利權）人: 南京中醫藥大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

大腸桿菌是食品中常見的致病菌，其檢測一般依賴細菌培養過程而周期較長。鑒于此，本發明提供一種具低泄露率、表面可連接大腸桿菌抗體的復合磷脂脂質體，其表面的抗體能夠與大腸桿菌特異性結合，內部所包封的熒光染料能夠發揮指示作用，而復合磷脂組成既能保證脂質體在抗體連接過程中的穩定性，也能夠有效提高脂質體在存放過程中的穩定性，最終能夠滿足食品中大腸桿菌現場快速檢測的需要，為保障食品安全提供了關鍵技術。

技術領域

本發明涉及藥劑與食品領域，具體涉及一種具低泄露率、表面可連接大腸桿菌抗體的復合磷脂脂質體及其應用，其目的是用于快速檢測大腸桿菌。

背景技術

大腸桿菌是一種常見的條件致病菌，也是導致食品污染的主要來源，因而是食品安全檢測的重要內容。但是，傳統的微生物學檢測方法耗時長，不能滿足快速檢測需要，而PCR技術、基因芯片技術等雖然可以快速檢測（一般需要幾小時到幾十小時），且檢測的特異性和靈敏度有了一定的提高，但檢測效率低，對儀器要求也較高，不適合推廣應用，尤其是無法滿足現場檢測的需要。采用大腸桿菌抗體表面修飾的載有熒光探針的脂質體可以用于檢測大腸桿菌，通過與其特異性結合和破膜后的熒光強度直觀表示出大腸桿菌的濃度，與現有的方法相比，速度更快（一小時以內），簡便易行，可以滿足食品現場檢測的需求，從而提升食品安全保障水平。

抗體是能夠與病原體特異性結合的常用生化試劑，通過馬來酰亞胺雙鍵與巰基加成反應形成穩定的硫醚鍵這一化學合成原理可以將硫代抗體連接到脂質體表面。這一反應需要孵育過程，如采用不飽和磷脂如天然的大豆磷脂（SPC）易導致脂質體內容物的泄漏，因而采用飽和合成磷脂如二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC）制備脂質體，這種飽和磷脂雖然能提高脂質體在存放過程中的穩定性，但其價格昂貴（超過天然磷脂價格的一百倍），嚴重限制了其推廣應用，需要采用新技術加以解決。

發明內容

解決技術問題：為了解決現有技術的不足，本發明提供一種具低泄露率、表面可連接大腸桿菌抗體的復合磷脂脂質體，通過復合磷脂的應用解決孵育過程中不飽和磷脂脂質體的泄漏問題，并且能夠顯著提升不飽和磷脂的抗氧化效果，從而保證表面連接大腸桿菌抗體的載體的穩定性，進而為其在食品安全檢測中的應用奠定了基礎。

技術方案：為實現以上目的，本發明提供一種具低泄露率、表面可連接大腸桿菌抗體的復合磷脂脂質體，并提供了制備方法以及在大腸桿菌檢測中的應用。

本發明提供一種具低泄露率、表面可連接大腸桿菌抗體的復合磷脂脂質體，處方中包含復合磷脂、N-（（4-馬來酰亞胺甲基）環己烷-1-羰基）-1,2-二十六烷基-1-硝基苯丙三醇-3-磷酸乙醇胺（MMCC-DHPE），磺酰羅丹明B，其中所述復合磷脂由氫化大豆磷脂和大豆磷脂按如下重量配比制成：氫化大豆磷脂1~5份，大豆磷脂1~10份，所述磺酰羅丹明B的重量配比為0.05~0.3份。

作為本發明的進一步改進，所述復合磷脂由氫化大豆磷脂與大豆磷脂按重量配比1:3~3:1制成，優選1：1。

作為本發明的更進一步改進，所述MMCC-DHPE與所述復合磷脂的重量比為1:10~1:40，優選1：20。

本發明同時提供上述復合磷脂脂質體的制備方法，采用逆相蒸發法制備。將所述磷脂溶于氯仿中，加入熒光探針磺酰羅丹明B的磷酸鹽緩沖液，超聲，45℃于旋轉蒸發儀上真空蒸發除去有機相，將所得的脂質體通過探頭超聲或擠出工藝減小粒徑至150nm以下，Sephadex G-50凝膠柱層析除去未包封的熒光探針，即得。

作為本發明的一種改進方式，上述復合磷脂脂質體通過馬來酰亞胺雙鍵與巰基加成反應制成連接硫代大腸桿菌抗體。其中硫代大腸桿菌抗體由以下方法制備所得：將大腸桿菌抗體在0℃和氮氣條件下與過量的2-亞胺噻吩反應，然后通過Sephadex G-25色譜柱除去多余的2-亞胺噻吩，所得。

作為一種優選方案，所述硫代大腸桿菌抗體與所述復合磷脂脂質體的重量比為1:25~1:100，最優選為1:50。