[發明專利]一種雙特異性抗體細胞株的構建和篩選方法

在審

• 申請號: 202010175300.9
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111394387A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 李智
• 申請（專利權）人: 蘇州智享眾創孵化管理有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/13;C12N5/10
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 李寶碩

本發明公開了一種雙特異性抗體細胞株的構建和篩選方法，包括以下步驟：以SNT70為表達載體，分別構建抗CD20抗體的表達質粒、抗CD3抗體的表達質粒；將抗CD20抗體的表達質粒、抗CD3抗體的表達質粒轉染至宿主細胞中，得到目的細胞株；培養步驟(1)所述的目的細胞株并進行純化，得到抗CD20×CD3雙特異性抗體。本發明公開的方法操作簡單，制得的雙特異性抗體純度高。

技術領域：

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種雙特異性抗體細胞株的構建和篩選方法。

背景技術：

雙特異性抗體(bispecific antibody，BiAb)是含有兩種特異性抗原結合位點的人工抗體，能在靶細胞和功能分子(細胞)之間架起橋梁，產生導向性的效應功能。BiAb在生物醫學中，特別是在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應用前景。通過BiAb介導細胞毒作用殺死腫瘤細胞是當前免疫治療應用研究的熱點，其主要特點是BiAb能同時結合腫瘤相關抗原和免疫效應細胞上的靶分子，直接觸發免疫效應細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。

目前，中國倉鼠卵巢細胞(CHO,Chinese hamster ovary cell)廣泛用于生產抗體，通常高產的細胞株一方面是通過甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)或者蛋氨酸砜亞氨(methionine sulfoximine，MSX)進行加壓擴增來得到，另一方面也有很多報道通過基因工程來得到高產細胞株。許多公司通過構建高轉染效率的質粒，例如轉座載體(Transposon)可以大幅度的提高外源基因的整合效率，從而提高抗體產量或者通過增加增強子及隔離子來增強啟動子的活力進而提高細胞株的表達能力。從傳統的實驗流程上來看，該過程通常需要4到8個月才能得到穩定的細胞株系，且需要消耗大量的人力物力，最終也不一定能夠獲得理想的高產細胞株。因此在單抗藥物開發過程中，除了構建良好的高表達的質粒載體，提高轉染效率等途徑外，還需要找到一種方便快捷的能夠提前篩選出高產細胞株，以及后期監測細胞株穩定性的方法，這樣不僅能夠縮短試驗周期，并且可以減少人力物力的投入，這也是制備雙特異性抗體成功的關鍵。

目前，單克隆抗體細胞株構建的方法已經趨于成熟，然而針對雙特異性抗體而言仍然缺少完善的細胞株構建和篩選的方法，大多數公司仍然采用現有的表達單克隆抗體的細胞株的構建方法，缺乏合理的設計，帶來了大量的篩選工作，從而極大地延長了藥物的開發周期，且制得的雙特異性抗體的純度不夠。

發明內容：

本發明要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種雙特異性抗體細胞株的構建和篩選方法。該方法能夠大幅降低同源二聚體的形成，得到的雙特異性抗體的純度高，且細胞株的構建和篩選周期大大減少。

為更好的解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

一種雙特異性抗體細胞株的構建和篩選方法，包括以下步驟：

(1)以SNT70表達載體，分別構建抗CD20抗體的表達質粒、抗CD3抗體的表達質粒；將抗CD20抗體的表達質粒、抗CD3抗體的表達質粒轉染至宿主細胞中，得到目的細胞株；

(2)培養步驟(1)所述的目的細胞株并進行純化，得到抗CD20×CD3雙特異性抗體。

作為一種優選的技術方案，目的細胞株的具體制備方法為：以SNT70為表達載體，分別將抗CD20抗體的基因和抗CD3抗體的基因連接到SNT70載體上，并同時分別轉染至宿主細胞中，經過克隆挑選后得到目的細胞株。

所述抗CD20抗體的重鏈、輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.2所示；所述抗CD3抗體的重鏈、輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.4所示。