[發明專利]一種促進番茄生長發育的方法

有效

• 申請號: 202010175241.5
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111321165B
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 周杰;王開心;潘燕婷;喻景權
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/84;A01H5/00;A01H5/10;A01H6/82
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

本發明公開了一種促進番茄生長發育的方法，在番茄中抑制表達堿基序列如SEQ ID NO：1所示的miR171b基因。本發明通過CRISPR/Cas9技術抑制番茄miR171b的表達，產生miR171b突變體植株，可促進番茄生長發育，具體表現有促進番茄種子萌發，促進苗期生長，提高番茄產量及品質。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種促進番茄生長發育的方法。

背景技術

MicroRNAs(miRNAs)是一類廣泛存在于生物體的內源非編碼小RNA，長度大多為21～24nt，通過在轉錄或轉錄后水平調控其靶基因的表達從而在植物生長發育、信號轉導、生物或非生物脅迫中發揮重要作用。miR171作為古老且保守程度較高的miRNA之一，在多個物種中已有廣泛研究。miR171b作為miRNAs家族中的重要一員，它在植物非生物逆境脅迫中通過參與調控赤霉素與生長素的平衡從而發揮重要作用，對于植物生長發育也會產生影響。

番茄(Solanum lycopersicum L.)是茄科(Solanaceae)茄屬中的一年生或多年生草本植物，別名西紅柿、洋柿子，是世界范圍內栽培最廣、消費量最大的蔬菜作物，因其生長周期相對短，設施栽培技術日趨成熟，是一種重要的呼吸躍變型果實，逐漸成為植物分子研究的重要模式植物之一。

前期研究結果表明，同一個miRNAs家族中的成員可能在不同植株、不同脅迫中發揮著不同的調控作用。比如過量表達番茄miR169c增強了植株的干旱抗性，但在擬南芥中，過量表達miR169a則增加植株對干旱的敏感性。因此，對于同一miRNA基因，不能一概而論。前期已有報道，通過將基因miR171在擬南芥、黃瓜、水稻、大麥等作物中進行過表達，對于植物的生長發育產生了一定程度的影響。具體為擬南芥miR171通過靶向GRAS家族基因Scarecrow-Like(SCL)調控擬南芥的分枝性和葉綠素生物合成；過表達Csa-miR171a擬南芥株系表現為抑制主根伸長、側根數量增加、抽薹時間提前，過表達黃瓜Csa-miR171a顯著影響擬南芥葉綠素積累，與擬南芥中過表達miR171靶向SCL轉錄因子間接調控植物葉綠素合成研究結果相同；在水稻中過量表達os-miR171b后，轉基因株系和野生型對照相比，超表達株系穗變長，結實量增加；大麥miR171過表達能夠激活miR156對其下游靶基因表達抑制，導致植物營養生長向生殖生長轉變。

發明內容

針對本領域存在的不足之處，本發明提供了一種促進番茄生長發育的方法，通過CRISPR/Cas9技術抑制番茄miR171b的表達，產生miR171b突變體植株，可促進番茄生長發育，具體表現有促進番茄種子萌發，促進苗期生長，提高番茄產量及品質。

一種促進番茄生長發育的方法，在番茄中抑制表達堿基序列如SEQ ID NO：1所示的miR171b基因。

在目標番茄中對miR171b基因進行抑制表達，可為任何可降低目標番茄中所述miR171b基因的表達的方法。在本發明中，在目標番茄中對miR171b基因進行抑制表達是通過構建該基因的CRISPR/Cas9載體進而通過農桿菌侵染的方式實現的。

具體地，可向目標番茄中導入番茄miR171b基因的CRISPR/Cas9載體進行抑制表達，得到miR171b基因抑制表達的突變體植株。

作為優選，所述促進番茄生長發育的方法包括步驟：

(1)構建含番茄miR171b基因CRISPR/Cas9載體的根癌農桿菌工程菌A；

(2)將所述根癌農桿菌工程菌A介導轉化目標番茄外植體，制備得到miR171b基因抑制表達的突變體植株。

步驟(1)中，所述番茄miR171b基因的堿基序列如SEQ ID NO：2所示。

步驟(2)中，所述外植體優選為種子發芽6～8天的子葉。