[發明專利]一種單細胞單管樣品制備及單細胞蛋白質組學分析方法

在審

• 申請號: 202010174861.7
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN112834631A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 張鵬飛;賀毅
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;G01N30/88
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所(普通合伙) 43114
• 代理人: 盛武生;魏娟

1.一種基于單管處理的單細胞蛋白質組學分析樣品制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟(1)：采用十二烷基-β-D-麥芽糖苷對測試管內壁進行預處理；

步驟(2)：向預處理后的測試管中加入待測定的單細胞；利用單管處理方式，在該測試管中對單細胞進行細胞裂解，蛋白酶解處理，在所述的測試管中獲得肽段待測溶液。

2.如權利要求1所述的基于單管處理的單細胞蛋白質組學分析樣品制備方法，其特征在于，步驟(1)的預處理步驟為：向測試管中添加十二烷基-β-D-麥芽糖苷溶液，浸泡后倒出溶液，并干燥。

3.如權利要求2所述的基于單管處理的單細胞蛋白質組學分析樣品制備方法，其特征在于，步驟(1)中，十二烷基-β-D-麥芽糖苷溶液的溶質的質量百分比為0.05～0.50％。

4.如權利要求2所述的基于單管處理的單細胞蛋白質組學分析樣品制備方法，其特征在于，步驟(1)中，浸泡的時間大于或等于12h。

5.如權利要求1～4任一項所述的基于單管處理的單細胞蛋白質組學分析樣品制備方法，其特征在于，步驟(2)蛋白裂解體系中添加有十二烷基-β-D-麥芽糖苷溶液。

6.如權利要求5所述的基于單管處理的單細胞蛋白質組學分析樣品制備方法，其特征在于，步驟(2)中，十二烷基-β-D-麥芽糖苷溶液的溶質的質量百分濃度為0.005～0.10％。

7.如權利要求5任一項所述的基于單管處理的單細胞蛋白質組學分析樣品制備方法，其特征在于，步驟(2)中，采用DTT-IAA-胰蛋白酶裂解體系在所述的測試管中對單細胞蛋白進行細胞裂解、蛋白質變性、蛋白質還原烷基化、蛋白質酶解過程。

8.如權利要求7所述的基于單管處理的單細胞蛋白質組學分析樣品制備方法，其特征在于，步驟(2)中，裂解步驟為：

步驟(2-1)：向預處理測試管中添加十二烷基-β-D-麥芽糖苷溶液，再加入單細胞；

步驟(2-2)：加入DTT溶液并孵育；

步驟(2-3)：步驟(2-2)孵育后再添加IAA溶液，并孵育；

步驟(2-4)：步驟(2-3)孵育后加入胰蛋白酶溶液，進行酶解反應；

步驟(2-5)：終止酶解，即得所述的肽段待測溶液。

9.如權利要求8所述的基于單管處理的單細胞蛋白質組學分析樣品制備方法，其特征在于，步驟(2-1)：往所述的測試管中加入1～2μL的0.005～0.10％DDM溶液，隨后經離心處理；

步驟(2-2)：步驟(2-1)離心后加入0.1～0.5μL40～60mmol/L DTT溶液，離心后再在80～90℃恒溫孵育0.5～1.5h；離心處理；

步驟(2-3)：步驟(2-2)離心后0.4～0.6μL的25～35mmol/L IAA溶液，并在50～60℃下黑暗孵育20～40min，隨后離心；

步驟(2-4)：步驟(2-2)離心后加0.9～1.1μL的25～35ng/μL胰蛋白酶溶液；并加入1.5～1.9μL NH₄HCO₃溶液定容至5～7μL，37℃下進行酶解反應；

步驟(2-5)：加入0.4～0.6μL 的4～6％FA溶液終止酶解，離心得到所述的待測溶液。

10.一種單細胞蛋白質組學分析方法，其特征在于，采用權利要求1～9任一項方法獲得裝有所述肽段待測溶液的測試管，隨后直接進樣、進行LC-MS/MS測定，并對測定結果進行蛋白組學分析。