[發明專利]一種SARS-COV-2病毒多重熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202010174838.8
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111139317A
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 王麗華;賀夢醒;鐵曉威
• 申請（專利權）人: 歐陸分析技術服務（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 劉洪勛

1.一種SARS-COV-2病毒多重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：從樣本中提取SARS-COV-2病毒，通過一步多重熒光探針體外擴增法同時擴增SARS-CoV-2病毒的ORF1ab基因和N基因片段，對擴增產物進行多重熒光定量PCR檢測，所述ORF1lab基因的特異性引物和熒光探針序列如下：

上游引物具有SEQ ID NO.1的堿基對序列；

下游引物具有SEQ ID NO.2的堿基對序列；

熒光探針具有SEQ ID NO.3的堿基對序列；

所述N基因的特異性引物和熒光探針序列如下：

上游引物具有SEQ ID NO.4的堿基對序列；

下游引物具有SEQ ID NO.5的堿基對序列；

熒光探針具有SEQ ID NO.6的堿基對序列。

2.根據權利要求1所述的SARS-COV-2病毒多重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：還通過一步多重熒光探針體外擴增法同時擴增了一個用于質控的MS2片段，所述MS2片段的特異性引物和熒光探針序列如下：

上游引物具有SEQ ID NO.7的堿基對序列；

下游引物具有SEQ ID NO.8的堿基對序列；

熒光探針具有SEQ ID NO.9的堿基對序列。

3.根據權利要求2所述的SARS-COV-2病毒多重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：所述SARS-COV-2病毒多重熒光定量PCR檢測方法中的陽性對照為合成的病毒質粒核酸序列，包括所述ORF1lab基因、N基因和MS2片段，所述SARS-COV-2病毒多重熒光定量PCR檢測方法中的陰性對照是無菌水。

4.根據權利要求1所述的SARS-COV-2病毒多重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：取樣品；

步驟二：使用病毒RNA提取試劑，凈化柱，提取和純化樣品中的RNA；

步驟三：以所述步驟二中的RNA為模板，在50度的溫度下，通過反轉錄酶轉錄得到對應DNA，DNA模板在PCR反應液中，利用熱啟動Taq聚合酶，在設定的鏈式反應條件下，進行PCR循環反應；

步驟四：選擇FAM，HEX，Cy5為多重反應同時測試，設定閾值，由電腦分析并得到Ct值。

5.根據權利要求4所述的SARS-COV-2病毒多重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：所述步驟二中的PCR反應體系終濃度組成如下：

PCR緩沖液中Mg²⁺濃度為3.3mM，dNTP的濃度為0.1-0.5mM，SARS-CoV-2特異性基因的上游引物、下游引物和探針上下游引物濃度為0.1-1.0M，探針濃度為0.1-0.5M，Taq酶濃度為0.5-5U/反應，每個測試20-1000個拷貝病毒基因組模板；

所述步驟二中的反應條件為：50℃RNA逆轉錄15min，95℃水解、熱啟動DNA 15min，94℃15S退火，55℃延伸。

6.一種SARS-COV-2病毒多重熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括用于檢測SARS-COV-2病毒的所述權利要求1中ORF1ab基因和N基因序列的特異性引物和熒光探針序列，所述ORF1ab基因和N基因序列的特異性引物和熒光探針序列作為陽性對照使用。

7.根據權利要求6所述的SARS-COV-2病毒多重熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于：還包括所述權利要求2中MS2片段的特異性引物和熒光探針序列，所述MS2片段的特異性引物和熒光探針序列在檢測SARS-COV-2病毒的過程中作為過程控制參考物使用。

8.根據權利要求7所述的SARS-COV-2病毒多重熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括PCR反應液、反轉錄酶、熱啟動酶、所述過程控制參考物、陰性對照和所述陽性對照。