[發明專利]一種重組鰻弧菌TolC蛋白及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010174732.8
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111732641A
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 邱礽;闞云超;姚倫廣;管翠翠;蔣長軍;冷超糧;史鴻飛;李娜;劉飛;冀君
• 申請（專利權）人: 南陽師范學院
• 主分類號: C07K14/28
• 分類號: C07K14/28;C12N15/31;C12N15/70;A61K39/106;A61P31/14;A61K38/16;A61P37/04
• 代理公司: 鄭州銘晟知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 41134
• 代理人: 張鵬

本發明屬于疫苗技術領域，具體涉及一種重組鰻弧菌TolC蛋白及其制備方法和應用。該重組鰻弧菌TolC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，該重組鰻弧菌TolC蛋白可用于增強水產動物對鰻弧菌的免疫，免疫效果好。

技術領域

本發明屬于疫苗技術領域，具體涉及一種重組鰻弧菌TolC蛋白及其制備方法和應用。

背景技術

鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是一種革蘭氏陰性菌，能夠感染包括魚類、蝦類、貝類等多種水產動物，鰻弧菌感染可導致弧菌病，該病是世界流行性疾病，可發生在任何季節，多年來給世界產業養殖造成了嚴重的經濟損失。

常見報道的魚類疫苗有滅活疫苗、減毒疫苗、核酸疫苗和亞單位疫苗等。亞單位疫苗因其接種劑量小、免疫原性強、抗體出現早、滴度高、持續時間長和毒副作用小等優點而得到關注。中國專利文獻CN 102988968A即公開了一種利用鰻弧菌鞭毛蛋白的疫苗及其應用，其以鰻弧菌C312為模板進行PCR擴增，并通過大腸桿菌表達系統表達得到了重組鰻弧菌鞭毛蛋白FlaB，該重組鰻弧菌鞭毛蛋白FlaB與佐劑混合后用于免疫牙鲆，對免疫后的牙鲆進行終濃度為5x10⁶ cfu/ml的鰻弧菌懸液100uL的攻毒實驗，該疫苗的相對免疫保護效率可達78％。其中，重組鰻弧菌鞭毛蛋白的用量為15μg。

重組的外膜蛋白能夠保持天然的免疫原性，刺激魚體后產生特異性抗體，對病原菌的感染產生一定的免疫保護效率，某些還能夠顯著的增強宿主吞噬細胞的吞噬活性，因此逐步成為魚類亞單位疫苗研究的熱點。

細菌外膜蛋白雖然是一個很重要的免疫原，在疫苗中的應用報道很多，但并不是所有外膜蛋白都具有免疫保護效應，并且在不同菌株中同一種外膜蛋白的免疫保護效應也有一定差異。

發明內容

本發明提供一種重組鰻弧菌TolC蛋白，以解決現有技術中鰻弧菌外膜蛋白免疫原性弱的問題。該重組鰻弧菌TolC蛋白可在用量更少的情況下取得與上述重組鰻弧菌鞭毛蛋白FlaB相當的免疫保護效果。

本發明的目的之二在于提供了所述重組鰻弧菌TolC蛋白的制備方法。

本發明的目的之三在于提供了一種鰻弧菌疫苗。

本發明的目的還在于提供了所述重組鰻弧菌TolC蛋白的用途。

本發明的重組鰻弧菌TolC蛋白采用如下技術方案：一種重組鰻弧菌TolC蛋白，所述重組鰻弧菌TolC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重組鰻弧菌TolC蛋白用于增強水產動物對鰻弧菌的免疫。

優選的，編碼所述重組鰻弧菌TolC蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明的重組鰻弧菌TolC蛋白的制備方法，采用如下技術方案：包括下述步驟：(1)以鰻弧菌C312為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增外膜蛋白TolC基因；(2)將步驟(1)所得PCR擴增產物與pEASY-T1 simple載體連接，連接液轉化大腸桿菌DH5a，篩選質粒為TolC-Ts；(3)再將所述質粒TolC-Ts用限制性內切酶SmaI酶切后，純化、回收TolC基因片段，并構建重組表達質粒pEtTolC；(4)將所述重組表達質粒pEtTolC轉化大腸桿菌BL21(DE3)，表達即為SEQ ID NO.1中的氨基酸序列所示的重組鰻弧菌TolC蛋白；

所述引物為F1:5’-CCCGGGATGAATTGGATGAACATGAAAACG–3’，帶有SmaI酶切位點；R1:5’-CCCGGGGTACTCCACCGCATCATGC-3’，帶有SmaI酶切位點；

所述鰻弧菌C312保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為：CGMCCNo.6250。