[發明專利]一種葉酸熒光素綴合物的制備方法

在審

• 申請號: 202010174726.2
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN113387952A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 黃保華;戴建;胡新禮;劉曉棟
• 申請（專利權）人: 蘇州宜百奧生物科技有限公司
• 主分類號: C07D475/04
• 分類號: C07D475/04
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司 32102
• 代理人: 蔣慧妮

1.一種葉酸熒光素綴合物的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：以Rink樹脂為樹脂固相載體，和Fmoc-Lys(Dde)-OH偶聯得到Fmoc-Lys(Dde)-Rink樹脂；以HOBT/DIC、HBTU/DIEA或TBTU/DIEA為縮合劑，通過固相合成法，按照主鏈肽序依次偶聯具有N端Fmoc保護，且側鏈保護的氨基酸，得到全保護肽樹脂；然后對肽樹脂進行裂解，脫除保護基和樹脂，加入無水乙醚析出，得到粗肽；采用反相高效液相色譜進行分離純化，凍干，得到葉酸熒光素綴合物。

2.如權利要求1所述的一種葉酸熒光素綴合物的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1、FA-Asp-Lys(Dde)-Rink樹脂的合成；

S11、取Rink樹脂置于固相反應柱中，用溶脹樹脂20min，抽掉溶液；

S12、稱取Fmoc-Lys(Dde)-OH、HOBt，DMF溶解，待溶解澄清后加入DIC，將混合溶液加入反應柱中，反應2～3h；

S13、用DBLK脫Fmoc，DMF洗滌至哌啶和副產物無殘留；

S14、重復S12、S13步驟，偶聯Fmoc-Asp-OH，Fmoc-Glu-OtBu，蝶酸得到FA-Asp-Lys(Dde)-Rink樹脂，甲醇收縮兩次，真空干燥，得到肽樹脂；

S2、FA-Asp-Lys(Cy5)-Rink樹脂的合成；

S21、取S4制得的肽樹脂在固相反應柱中，溶脹；

S22、加入預先配置好的水合肼和DMF混合溶液，去除Dde保護基兩次，每次反應5-15min；所述混合溶液體積比為，水合肼：DMF＝2:98；

S23、通過DMF洗滌后稱取Cy5-COOH、HATU，并用DMF溶解后加入反應中，氮氣鼓吹，反應2-3h，甲醇收縮兩次，空干燥，得到肽樹脂；

S3、葉酸熒光素綴合物的合成；

S31、在S23得到的肽樹脂加入裂解試劑，溫室反應1-3h；

S32、過濾，將濾液倒入冰凍乙醚，析出黃的顆粒，離心，再用乙醚洗滌，真空干燥，得到粗品。

S33、通過RP-HPLC純化，凍干得到，純度＞95％的黃色固體，即葉酸熒光素綴合物。

3.如權利要求2所述的一種葉酸熒光素綴合物的制備方法，其特征在于：所述S11中用于溶脹Rink樹脂的試劑為DCM。

4.如權利要求2所述的一種葉酸熒光素綴合物的制備方法，其特征在于：所述S21中用于溶脹肽樹脂的試劑為DCM。

5.如權利要求2所述的一種葉酸熒光素綴合物的制備方法，其特征在于：所述S13中DMF洗滌5次。

6.如權利要求2所述的一種葉酸熒光素綴合物的制備方法，其特征在于：所述S23中DMF洗滌5次。

7.如權利要求1所述的一種葉酸熒光素綴合物的制備方法，其特征在于：所述S31中的裂解試劑為TFA:Tis:H₂O:DTT＝90:2.5:2.5:5。