[發(fā)明專利]一種重組鰻弧菌OmpA蛋白及其制備方法和應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010173845.6
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111732640A
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發(fā)明（設計）人: 邱礽;闞云超;姚倫廣;管翠翠;蔣長軍;冷超糧;史鴻飛;李娜;劉飛;冀君
• 申請（專利權）人: 南陽師范學院
• 主分類號: C07K14/28
• 分類號: C07K14/28;C12N15/70;A61K39/106;A61P31/04;C12R1/63
• 代理公司: 鄭州銘晟知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙) 41134
• 代理人: 張鵬

1.一種重組鰻弧菌OmpA蛋白，其特征在于，所述重組鰻弧菌OmpA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重組鰻弧菌OmpA蛋白用于增強水產(chǎn)動物對鰻弧菌的免疫。

2.根據(jù)權利要求1所述的重組鰻弧菌OmpA蛋白，其特征在于，編碼所述重組鰻弧菌OmpA蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的重組鰻弧菌OmpA蛋白的制備方法，其特征在于，包括下述步驟：(1)以鰻弧菌C312為模板，采用F1/R1為引物進行PCR擴增外膜蛋白OmpA基因；(2)將步驟(1)所得PCR擴增產(chǎn)物與pEASY-T1 simple載體連接，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選質(zhì)粒為OmpA-Ts；(3)利用限制性內(nèi)切酶SmaI對所述OmpA-Ts載體進行酶切，酶切產(chǎn)物純化，回收得到OmpA基因片段；(4)將載體pET259用SwaI酶切后回收并將其與步驟(3)回收得到的OmpA基因片段用T4 DNA連接酶連接后連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pEtOmpA；(5)再將所述質(zhì)粒pEtOmpA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，表達即為SEQ ID NO.1中的氨基酸序列所示的重組鰻弧菌OmpA蛋白；

所述引物為F1:5’-CCCGGGATGATAACGATAAATAGGAAAG–3’；

R1:5’-CCCGGG TTTCACTTCATAATCAAAGCT-3’；

所述鰻弧菌C312保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為：CGMCCNO.6250。

4.一種鰻弧菌疫苗，其特征在于，所述鰻弧菌疫苗的原料包括如權利要求1或2所述的重組鰻弧菌OmpA蛋白。

5.根據(jù)權利要求4所述的鰻弧菌疫苗，其特征在于，采用腹腔注射所述鰻弧菌疫苗的方式進行免疫，所述重組鰻弧菌OmpA蛋白的用量為10μg/次，免疫一次后采用lx10⁷cfu/ml的鰻弧菌對被免疫水產(chǎn)動物進行攻毒，相對免疫保護效率可達74％。

6.根據(jù)權利要求4或5所述的鰻弧菌疫苗，其特征在于，所述鰻弧菌疫苗的原料還包括佐劑。

7.根據(jù)權利要求6所述的鰻弧菌疫苗，其特征在于，所述佐劑為Al(OH)₃，所述佐劑由5wt％NaOH和5wt％Al₂(SO₄)₃以2:5的體積比混合、離心后，將離心所得沉淀懸浮于PBS中至0.2mg/ml制備得到；所述鰻弧菌疫苗中重組鰻弧菌OmpA蛋白與佐劑的質(zhì)量比為1:1。

8.根據(jù)權利要求1或2所述的重組鰻弧菌OmpA蛋白在制備增強水產(chǎn)動物免疫力的藥物中的應用。

9.根據(jù)權利要求8所述的重組鰻弧菌OmpA蛋白的應用，其特征在于，所述水產(chǎn)動物包括但不限于魚類、蝦類和貝類。

10.根據(jù)權利要求9所述的重組鰻弧菌OmpA蛋白的應用，其特征在于，所述水產(chǎn)動物為牙鲆。