[發(fā)明專利]一種適配體及其在檢測PDGF-BB試劑盒中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010173438.5
• 申請日: 2020-03-13
• 公開（公告）號: CN111286503B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳俊;夏蘇平;謝文清;陳金香;謝寶平;劉叔文
• 申請（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12Q1/6844;G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

本發(fā)明公開了一種適配體及其在檢測PDGF?BB試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)一個(gè)基于適配體發(fā)卡的指數(shù)擴(kuò)增模板，實(shí)現(xiàn)均相溶液中PDGF?BB蛋白的快速靈敏檢測，其反應(yīng)速度快、特異性好、線性范圍寬、準(zhǔn)確度高，檢測限可達(dá)4.9fM，可用于微量PDGF蛋白的的檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于適配體的恒溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)均相溶液中快速靈敏檢測PDGF-BB蛋白質(zhì)的方法。

背景技術(shù)

血小板生長因子(PDGF)是一種在人血小板中的生長因子蛋白，在已公開的研究中，PDGF一般有多個(gè)亞型，如PDGF-AB、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC等。在這些亞型中，PDGF-BB被證實(shí)在癌癥中過表達(dá)，被認(rèn)為是一種有效的疾病診斷標(biāo)志物，因此，PDGF-BB的高靈敏檢測具有重要意義。

酶聯(lián)免疫(ELISA)是傳統(tǒng)的PDGF-BB檢測方法，然而其操作復(fù)雜，需要繁瑣冗雜的多次清洗，導(dǎo)致試驗(yàn)時(shí)間很長，同時(shí)該方法依賴于PDGF-BB抗體，受到抗體本身存在的易失活、保存困難和成本高等問題的限制。近年來，核酸適配體替代抗體作為一種識(shí)別手段已被廣泛用于蛋白質(zhì)傳感器的構(gòu)建。核酸適配體是一種采用體外指數(shù)富集配體技術(shù)篩選得到的寡核苷酸片段，它對小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等具有特異性結(jié)合的能力，與傳統(tǒng)抗體相比，具有高選擇性、穩(wěn)定性高和適用性強(qiáng)等優(yōu)勢。以核酸適配體為基礎(chǔ)的PDGF-BB檢測方法已在熒光、電化學(xué)、化學(xué)發(fā)光和比色等檢測平臺(tái)上得以建立。其中，基于熒光的方法具有儀器簡單、操作簡單和響應(yīng)迅速的優(yōu)點(diǎn)受到廣泛的應(yīng)用。然而，傳統(tǒng)基于適配體的測定PDGF-BB的熒光檢測方法存在靈敏度有限的問題。

恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(Exponential Amplification Reaction，EXPAR)技術(shù)近年來備受關(guān)注。該技術(shù)基于3′端與5′端序列完全相同，且均與引物序列互補(bǔ)的線性模板，在DNA聚合酶和特殊的切口酶(nicking enzyme)共同作用下，可以在恒溫條件下對短鏈核酸(10～25堿基)進(jìn)行高效、快速的擴(kuò)增，一般在幾分鐘內(nèi)可對目標(biāo)核酸放大106～109倍，將恒溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)與核酸適配體有機(jī)結(jié)合可有效實(shí)現(xiàn)均相溶液中蛋白質(zhì)的快速靈敏檢測。

近年來，研究者建立了多種基于適配體的核酸信號擴(kuò)增方法，證實(shí)了核酸恒溫?cái)U(kuò)增在PDGF-BB檢測中極強(qiáng)的信號擴(kuò)增能力。然而這些方法大都是非均相檢測，需要多次洗滌分離或設(shè)計(jì)多條核酸探針通過分步操作達(dá)到靈敏檢測的目的，方法耗時(shí)長且靈活度低，限制了其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于適配體的恒溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)均相溶液中快速靈敏檢測PDGF-BB蛋白質(zhì)的方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供：

一種識(shí)別PDGF-BB蛋白的適配體，其堿基序列為：

5’-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3’(SEQ ID NO.1)。

本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供：

一種包括上述適配體的擴(kuò)增模板，其還包括引物識(shí)別序列、擴(kuò)增序列和切口酶序列；

其中，上述擴(kuò)增模板為發(fā)卡結(jié)構(gòu)；

上述引物識(shí)別序列與上述適配體序列部分互補(bǔ)。

在本發(fā)明實(shí)施例中，上述擴(kuò)增序列數(shù)量為2個(gè)或以上，且核酸序列完全相同；上述切口酶序列數(shù)量為2個(gè)或以上。

在本發(fā)明實(shí)施例中，上述擴(kuò)增模板的溶解溫度60℃。

在本發(fā)明實(shí)施例中，上述擴(kuò)增模板序列選自以下核苷酸序列中任一條：