[發明專利]來源于土曲霉菌NIH2624的轉氨酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202010172593.5
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111363732B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 馮俊;唐圓圓;熊艷;艾忠良;佘飛;王文博
• 申請（專利權）人: 卡柔恩賽生物技術湖北有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 合肥方舟知識產權代理事務所(普通合伙) 34158
• 代理人: 朱榮

本發明公開涉及來源于土曲霉菌Aspergillus?terreus?NIH2624轉氨酶突變體的多肽、編碼所述多肽的多核苷酸以及使用所述多肽在(R)?3?氨基?1?芐基哌啶制備上的應用。本發明通過計算機模擬為指導定向改造土曲霉菌Aspergillus?terreus?NIH2624轉氨酶，改造氨基酸位點選自Y60、R79、W184、E213、G216、F217、N218、L235、G237、V238、T239、C273、T274及T275中的一個或多個。經改造獲得的突變體應用于(R)?3?氨基?1?芐基哌啶的生產，具有優良的立體選擇性和催化活力，且其催化的反應溫和，在相同的生產條件下，其活力相對于野生型轉氨酶提高了86.96倍，產物手性純度及收率均有明顯提高，具有較好的應用前景。

技術領域：

本發明屬于生物制藥領域，具體涉及一種來源于土曲霉菌NIH2624的轉氨酶突變體及其應用。

背景技術：

2017年底，國際糖尿病聯盟(IDF)公布了第八版的全球糖尿病概覽。結果顯示，全球糖尿病成人患者(20-79歲)從2000年的1.51億，到2017年已達到4.25億，增加近2倍。預計到2045年，糖尿病患者可能達到6.29億。糖尿病主要是由于機體胰島素分泌不足或胰島素作用障礙引起的以高血糖為特征的代謝疾病。其中胰島素分泌不足被定義為Ⅰ型、胰島素作用障礙被定義為Ⅱ型糖尿病，Ⅱ型糖尿病患者占糖尿病患者的90％以上。目前治療Ⅱ型糖尿病的藥物主要分為磺酰脲類、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑、噻唑烷二酮類、二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制劑等幾大類，其中目前公認最為高效安全的是(DPP-IV)抑制劑，該類藥物能夠選擇性與二肽基肽酶IV?可逆性結合從而抑制二肽基肽酶IV的活性，進而延緩胰高血糖素樣肽?-1(GLP-1)和抑胃肽(GIP)降解，從而調節糖尿?、蛐突颊叩难撬健?/p>

目前(DPP-IV)抑制劑類降血糖藥物阿格列汀、曲格列汀及利拉列汀的重要藥物中間體(R)-3-氨基-1-芐基哌啶，在總生產成本中占有較大比例?，F在主要生產工藝是采用化學還原的方法制備手性胺，即在Pd/C的催化作用下，前手性酮與甲酸以及無機氨/有機伯胺進行反應生成外消旋胺。此類反應中金屬催化劑是非常關鍵的因素，且對金屬催化劑要求苛刻，反應需要在高壓條件下完成，操作設備要求高，同時產生大量含重金屬離子的廢水難以處理，對環境造成較大污染。另外，金屬催化合成所需構型的手性胺含量通常為50％，遠遠不能滿足手性胺含量≥99.5％的需求，因此需要后續進行拆分精制，在浪費一半的產品、降低生產效率的同時，還產生大量廢有機溶劑，加大了環保處理的壓力。

發明內容：

為解決上述問題，本發明以來源于土曲霉菌?Aspergillus?terreus?NIH2624的轉氨酶基因XP_001209325.1為研究對象，通過計算機模擬軟件對XP_001209325.1理性預測并進行定點突變，以提高轉氨酶的選擇性及活性。

本發明的主要目的是提高來源于土曲霉菌Aspergillus?terreus?NIH2624?的轉氨酶對非天然底物1-芐基-3-哌啶酮催化活力，得到酶活顯著提高的轉氨酶突變體，解決現有(R)-3-氨基-1-芐基哌啶合成技術中存在的缺陷。

本發明的技術方案如下：

步驟1：候選轉氨酶與反應底物1-芐基-3-哌啶酮的分子對接評估(三級結構未鑒定的候選轉氨酶以同源建模的形成完成對接)。

步驟2：針對分子對接結果優選評估分數較高的轉氨酶進行活性測試。

步驟3：選擇催化活性與立體選擇性最高的Aspergillus?terreus?NIH2624?的轉氨酶作為本發明的野生型轉氨酶。

步驟4：利用模擬軟件虛擬突變Aspergillus?terreus?NIH2624轉氨酶活性中心周圍單個氨基酸。

步驟5:Aspergillus?terreus?NIH2624轉氨酶活性中心氨基酸區域虛擬組合突變。