[發明專利]一種冷凍保存液及其制備方法

有效

• 申請號: 202010172544.1
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111789108B
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 王健君;金晟琳;嚴杰;喬杰;閆麗盈;李蓉
• 申請（專利權）人: 中國科學院化學研究所;北京大學第三醫院（北京大學第三臨床醫學院）
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 黃越;焦健

本發明公開了一種冷凍保存液及其制備方法，含有PVA，乙二醇和蔗糖。所述冷凍保存液以PVA為主要低溫保護劑成分，DMSO含量低，毒性小，用于細胞或組織尤其是卵母細胞的冷凍保存時，能達到與商業化冷凍保存液(含有DMSO 15％)同等甚至更高的細胞存活率和功能表達穩定性，具有較高的保存效率。本發明的冷凍保存液組成簡單，且原料來源方便，成本低廉，可廣泛應用于各類細胞、組織以及器官的冷凍保存。

本申請要求2019年4月9日向中國國家知識產權局提交的專利申請號為201910282416.X，發明名稱為“一種基于PVA的冷凍保存液及其制備方法”的在先申請的優先權。該在先申請的全文通過引用的方式結合于本申請中。

技術領域

本發明屬于生物醫用材料技術領域，具體涉及一種基于PVA的冷凍保存液及其制備方法。

背景技術

冷凍保存是指將細胞、組織或器官保存于超低溫狀態下，使細胞新陳代謝和分裂速度減慢或者停止，一旦恢復正常生理溫度又能繼續發育。該技術自問世以來，成為自然科學領域不可缺少的研究方法之一，已被廣泛采用。近年來，隨著生活壓力的增加，人類生育力呈逐年下降的趨勢，生育力保存越來越受到人們的重視，人類生殖細胞(精子、卵母細胞)、性腺組織等的冷凍保存就成為保存生育力的重要手段。另外，隨著世界人口老齡化加劇，對捐贈的可用于再生醫學和器官移植的人源性細胞、組織或器官的冷凍保存的需求也極速增加。因此，如何高效的冷凍保存珍貴的細胞、組織以及器官資源以備不時之需成為亟待解決的科學技術問題。

目前最常用的冷凍保存方法為玻璃化冷凍。玻璃化冷凍技術雖然在快速冷凍過程中可使細胞內外的液體直接成為玻璃態而避免了冷凍過程中因冰晶形成而導致的損傷。但是，在復溫過程中，現有的冷凍保存試劑不能有效的控制冰晶的生長，從而損害細胞。目前玻璃化冷凍方法所使用的高濃度(≥15％)的有機溶劑，如：DMSO，導致冷凍保存試劑對細胞的毒副作用，嚴重影響冷凍保存對象復蘇后的存活率甚至(子代)安全性以及功能表達。綜上，目前采用的冷凍保存試劑不具備復溫過程中有效控制冰晶生長的能力，同時存在試劑毒性大的問題。

發明內容

為改善現有技術的上述缺陷，本發明提供一種基于PVA的冷凍保存液及其制備方法。

本發明提供如下技術方案:

一種冷凍保存液，以每100mL體積計，含有PVA 0.01-6.0g，多元醇5.0-45mL，水溶性糖0.1-1.0mol L^-1，DMSO 0-15mL，血清0-30mL，和緩沖液余量。

根據本發明，所述PVA選自無規PVA，例如所述PVA的間同規整度為45％-65％、50％-55％。

根據本發明，所述PVA可選自分子量為10-500kDa或者更高分子量的PVA，例如分子量為10-30kDa、30-50kDa、80-90kDa、200-500kDa。

根據本發明，所述PVA可選自水解度為大于80％的PVA，例如水解度為80％-99％、82-87％、87％-89％、89％-99％、98％-99％。

根據本發明，所述多元醇可以為碳原子數2-5的多元醇，優選碳原子數2-3的二元醇、三元醇，例如乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一種。

根據本發明，所述水溶性糖可以為非還原性雙糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一種，例如選自蔗糖、海藻糖、水溶性纖維素、聚蔗糖；優選蔗糖、羥丙基甲基纖維素等。所述水溶性糖可以起到保護細胞膜和避免細胞沉降的作用。

根據本發明，所述血清針對人源性冷凍保存對象可選人血清白蛋白或替代物，例如十二烷基磺酸鈉SDS，針對非人源性冷凍保存對象可選胎牛血清或牛血清白蛋白。

根據本發明，所述緩沖液可以為DPBS、hepes-buffered HTF緩沖液、其他已知的細胞培養緩沖液中的至少一種。