[發明專利]一種新型鴨呼腸孤病毒的復合疫苗及卵黃抗體制備方法

有效

• 申請號: 202010172362.4
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111440815B
• 公開（公告）日: 2022-12-16
• 發明（設計）人: 王輝;王宏華;張勇;王秀云;李佳禮;辛瑞祥;劉磊;焦緒娜;曹陽
• 申請（專利權）人: 濰坊華英生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/64;A61K39/15;A61P31/14;C07K16/10;C07K16/02
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 周曉娜

本發明的目的是提供一種新型鴨呼腸孤病毒的復合疫苗及卵黃抗體制備方法，即將含新型鴨呼腸孤病毒σB蛋白基因的重組PVAX1?σB質粒與新型鴨呼腸孤病毒σC蛋白按一定比例混合后與白油佐劑乳化制備復合疫苗，三免后7～150日所采集雞蛋的平均抗體效價達1:1024以上，最高抗體效價可達1:4096。高免蛋提取純化制備的卵黃抗體產品可對感染新型鴨呼腸孤病毒的鴨群提供完全保護。本發明方法制備的新型鴨呼腸孤病毒卵黃抗體效果確實、成本低廉，具有顯著的經濟與社會效益。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種新型鴨呼腸孤病毒的復合疫苗及卵黃抗體制備方法。

背景技術

新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)，為呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬成員，主要引起雛鴨肝脾出血和壞死，臨床上稱之為“鴨新肝病”、“鴨白點病”、“鴨出血性壞死性肝炎”、“鴨脾壞死病”等。新型鴨呼腸孤病毒在血清學上完全不同于之前的番鴨呼腸孤病毒，未見明顯交叉保護性。2005年前后該病先在我國南方一些省份，如福建省、廣東省、浙江省等鴨群中開始出現，后蔓延至全國主要養鴨區，給我國養鴨業造成了巨大經濟損失。

新型鴨呼腸孤病毒含雙層衣殼，其中σC蛋白位于病毒外衣殼，由S1基因節段編碼。在病毒感染過程中，σC蛋白活化后形成同源三聚體與受體分子相互作用，介導病毒侵入易感細胞。此外，σC蛋白還能誘導機體產生保護性中和抗體，可作為基因工程疫苗的開發的候選蛋白。張云等(番鴨呼腸孤病毒MW9710σC蛋白基因克隆及其在E.coli中表達，畜牧獸醫學報，2005，36(4)，376-380)、王錦祥等(新型鴨呼腸孤病毒σC基因原核表達及其抗原性的初步研究，福建農業學報，2014,29(4)：310-313)在原核表達系統實現了σC蛋白的表達，Kuntz等(Baculovirus-expressed muscovy duck reovirus「C protein induces serumneutralizing antibodies and protection against challenge,2002,Vaccine 20:3113–3122)、畢莊莉等(Induction of a robust immunity response against novelduck reovirus in ducklings using a subunit vaccine of sigma C protein,Scientific Reports,2016,6:1-11)則在桿狀病毒表達系統實現了σC蛋白的基因工程表達，并證明可誘導動物機體產生一定的保護力。σB蛋白是呼腸孤病毒S3基因編碼的病毒外衣殼蛋白，是群特異性抗原，同時含有病毒的多個中和表位。Lin等(Baculovirus SurfaceDisplay of sigmaC and sigmaB Proteins of Avian Reovirus and Immunogenicity ofthe Displayed Proteins in a Mouse Model,2008,Vaccine,26(50):6361-7)用桿狀病毒表達系統分別表達了禽呼腸孤病毒σB蛋白與σC蛋白并在小鼠模型中進行試驗，結果表明小鼠產生了血清中和抗體。吳曉平等(原核表達番鴨呼腸孤病毒σC與σB蛋白對雛番鴨的免疫保護，2013，中國農業科學，2013，46(14)：3040-3045年)則用原核表達系統表達了番鴨呼腸孤病毒的σB蛋白與σC蛋白并乳化后制備疫苗免疫番鴨，結果σB蛋白與σC蛋白聯合制備的疫苗的攻毒保護率可達70％，而單個蛋白的保護率僅為40～60％。該方法的每個重組蛋白用量達到250μg/只，生產成本較高，且未進一步進行卵黃抗體產品研究。

唐熠等(專利申請號：CN201810494056.5、CN201810911067.9)、張立武等(專利申請號：CN201810720764.6)進行了鴨呼腸孤病毒卵黃抗體產品的研究，這些方法均采用雞胚或鴨培養的方式制備免疫蛋雞用的抗原，病毒生產效價低，易引入其他胚源病原，同時抗原免疫蛋雞后制備的高免雞蛋效價較低，相對來說生產成本也較高。

發明內容