[發(fā)明專利]一種新型鵝星狀病毒的復(fù)合疫苗及卵黃抗體制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010172345.0
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111454977B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王秀云;王宏華;焦緒娜;張勇;王輝;劉磊;李佳禮;辛瑞祥
• 申請（專利權(quán)）人: 濰坊華英生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/70;C07K16/10;C07K16/02;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 周曉娜

本發(fā)明的目的是提供一種新型鵝星狀病毒的復(fù)合疫苗及卵黃抗體制備方法，即將含新型鵝星狀病毒Cap蛋白基因的重組PVAX1?Cap質(zhì)粒與新型鵝星狀病毒mCap蛋白按一定比例混合后與白油佐劑乳化制備復(fù)合疫苗，三免后7～150日所采集雞蛋的平均抗體效價達(dá)1:64以上，最高抗體效價可達(dá)1:1024。高免蛋提取純化制備的卵黃抗體產(chǎn)品可對感染新型鵝星狀病毒的鵝群提供完全保護(hù)。本發(fā)明方法制備的新型鵝星狀病毒卵黃抗體效果確實、成本低廉，具有顯著的經(jīng)濟與社會效益。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型鵝星狀病毒的復(fù)合疫苗及卵黃抗體制備方法。

背景技術(shù)

星狀病毒(astrovirus，AstV)是一種無囊膜的、單鏈正義RNA病毒，直徑約為35nm。星狀病毒包含三個開放閱讀框(ORF)，其中ORF1編碼包括蛋白酶(ORF1a)和RNA依賴型RNA聚合酶(ORF1b)在內(nèi)的非結(jié)構(gòu)蛋白。ORF2編碼病毒衣殼蛋白(Cap蛋白，是基因組中的高變區(qū)域，特別是ORF2的3’端的Splike區(qū)，含有星狀病毒的多個中和抗體表位，常作為疫苗開發(fā)的靶蛋白。

自2017年2月份以來，我國山東、江蘇、安徽、河南、遼寧、廣東等主要養(yǎng)鵝地區(qū)暴發(fā)了一種以痛風(fēng)為主要特征的急性傳染病。該病主要侵害2周齡以內(nèi)的雛鵝，病鵝內(nèi)臟器官表面和關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量的尿酸鹽沉積，死亡率最高可達(dá)50％，給我國養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。后經(jīng)病毒分離、鑒定以及動物回歸試驗，確定是感染了一種新型鵝星狀病毒。作為一種新發(fā)疫病，養(yǎng)鵝業(yè)亟需合法的疫苗與特效治療藥物。

卵黃抗體產(chǎn)品常作為特效藥物用于疫病的緊急預(yù)防和治療。卵黃抗體的制備工藝中，優(yōu)選免疫原性突出的免疫抗原，使其最大化的刺激蛋雞的細(xì)胞免疫與體液免疫水平，獲得抗體滴度高、持續(xù)時間長的高免雞蛋，對降低卵黃抗體的生產(chǎn)成本具有顯著經(jīng)濟價值。唐熠等(專利申請?zhí)枺篊N201810494058.4)、常娓娓等(專利申請?zhí)枺篊N201810941620.3)、宋揚等(專利申請?zhí)枺篊N201811315086.1)報道了一些新型鵝星狀病毒卵黃抗體的制備方法，但這些方法均采用鵝胚培養(yǎng)的新型鵝星狀病毒作為免疫用抗原，病毒生產(chǎn)效價低，且易引入其他鵝源病原，同時制備的高免雞蛋效價也相對較低，影響了卵黃抗體的生產(chǎn)效率與產(chǎn)品質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新型鵝星狀病毒的復(fù)合疫苗及卵黃抗體制備方法。該制備方法優(yōu)選的新型鵝星狀病毒復(fù)合疫苗免疫蛋雞后可顯著提高蛋黃中新型鵝星狀病毒抗體效價，提取純化制備的卵黃抗體性質(zhì)穩(wěn)定、純度高，可大大降低新型鵝星狀病毒卵黃抗體的生產(chǎn)成本，對新型鵝星狀病毒病的預(yù)防及治療極具應(yīng)用價值。

根據(jù)GenBank中鵝星狀病毒Cap蛋白的氨基酸序列，設(shè)計一種新型鵝星狀病毒Cap蛋白，氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1。進(jìn)一步根據(jù)密碼子使用偏好性，設(shè)計獲得新型鵝星狀病毒Cap蛋白基因，其中一種核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2。

制備一種重組PVAX1-Cap質(zhì)粒，其是由上述獲得的新型鵝星狀病毒Cap蛋白基因與真核表達(dá)載體PVAX1通過酶切連接而成。該重組PVAX1-Cap質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后經(jīng)發(fā)酵、DNA提取純化等步驟進(jìn)行大量制備。

選取新型鵝星狀病毒Cap蛋白3’端富含中和抗體表位的Spike功能區(qū)，命名為新型鵝星狀病毒mCap蛋白，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:3。將新型鵝星狀病毒mCap蛋白進(jìn)行大腸桿菌稀有密碼子優(yōu)化，獲得的一種新型鵝星狀病毒mCap蛋白核苷酸序列SEQ?ID?NO:4。

將新型鵝星狀病毒mCap蛋白基因與表達(dá)載體pET28a連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)后進(jìn)行高密度發(fā)酵、菌體破碎、蛋白純化等步驟進(jìn)行新型鵝星狀病毒mCap蛋白的大量制備。

將重組PVAX1-Cap質(zhì)粒與新型鵝星狀病毒mCap蛋白混合制備水相。

優(yōu)選的水相中重組質(zhì)粒終濃度是20～100μg/ml，重組mCap蛋白終濃度為0.2～0.8mg/ml。