[發明專利]基于微鏡陣列的單物鏡光片熒光顯微成像裝置及方法

有效

• 申請號: 202010171110.X
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN111307772B
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 施可彬;劉志文;蔡艷輝;陳倚竹;楊宏
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G02B21/00;G02B21/36
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產權代理有限公司 11360
• 代理人: 王巖

1.一種基于微鏡陣列的單物鏡光片熒光顯微成像裝置的成像方法，其特征在于，所述成像方法包括以下步驟：

1)激發光光源產生高斯光，經過高斯光擴束準直系統后，進入貝塞爾光束產生系統；產生的貝塞爾光束經過聚焦透鏡聚焦到光束掃描系統，經過無限遠矯正光學系統的整形后作為激發光，經雙色鏡后進入激發物鏡入瞳；

2)激發光由于經過光束掃描系統之后，由激發物鏡聚焦后，在激發物鏡焦平面形成虛擬的數字激發光片，對樣品進行片狀激發；聚焦透鏡、無限遠矯正光學系統和激發物鏡滿足共焦條件，構成共焦系統，貝塞爾光束通過聚焦透鏡和無限遠矯正光學系統的共焦傳遞后，到激發物鏡焦平面處的聚焦光斑為軸向線光，由光束掃描系統，使軸向線光變為軸向面光形成數字激發光片，數字激發光片沿著軸向并垂直于樣品表面；

3)樣品位于激發物鏡焦平面處，樣品放置在壓電掃描系統上；

4)數字激發光片激發樣品產生熒光，即光片激發熒光信息，由同一激發物鏡進行信號收集，經過濾波片后經4f透鏡組傳遞至微鏡陣列系統；由于數字激發光片為軸向面光，從而收集到的光片激發熒光信息也沿軸向分布，因此，樣品不同深度的光片激發熒光信息，由微鏡陣列系統的不同位置反射；其中，微鏡陣列系統包括前端的聚焦物鏡、微鏡陣列以及后續的收集物鏡；其中，聚焦物鏡和收集物鏡均為長工作距離物鏡，前端的聚焦物鏡用來再次收集光片激發熒光信息；微鏡陣列為一系列沿軸向等間隔排布的微型反射鏡，每個微型反射鏡在縱向上視為無限長；調節前端的聚焦物鏡的聚焦軸向方向與微鏡陣列的排列方向水平，且聚焦軸線與微鏡陣列的中心線重合，并且，調節光片激發熒光信息平面與微型反射鏡平面平行，并使微鏡陣列平面位于光軸上，即微鏡陣列在俯仰上的精確調節，其中，微鏡陣列所在平面為YZ平面，且每一個微型反射鏡沿著Y方向周期排列，從而保證光片激發熒光信息最大程度上被傳遞到后續的收集物鏡，同時不會失真；每一個微型反射鏡的縱向為Z方向，微鏡陣列的周期排布方向為Y方向，即軸向為Y方向，具體調節方法如下：

a)微鏡陣列固定在一個二維俯仰調節塊上，并置于三維手動平移臺上，調節微鏡陣列在沿著光束傳播的軸線上無偏離，即微鏡陣列Y方向與光束傳播方向平行，打開白光照明系統，調節微鏡陣列的X方向，在信號收集系統中觀察到微鏡陣列的分布，循環調節微鏡陣列Y方向俯仰角和微鏡陣列沿Y方向的位置，直至在信號收集系統中觀察到微鏡陣列沿著Y方向移動過程中，在白光照明下全程不失焦，之后，在樣品處放置單個量子點，利用激發量子點獲得的光片激發熒光信息分布，調節微鏡陣列的X方向位置，使光束正好處于微鏡中心；

b)調節微鏡陣列平面與光片激發熒光信息平面平行，并使微鏡陣列平面位于光軸上，即微型反射鏡的縱向Z方向垂直于實驗平臺，以光片激發熒光信息平面與實驗平臺垂直為依據，同時打開白光照明系統與激發光系統，在信號收集系統內觀測到微鏡陣列在白光下的分布，以及熒光的分布；若熒光較弱則關閉白光照明系統，只在確定微鏡陣列的X方向位置時開啟；激發單個量子點能夠看到熒光只照亮其中部分微型反射鏡，此時使微鏡陣列沿著Z方向移動，如果看到聚焦的熒光光斑分離，說明此時微鏡陣列Z向存在傾斜；循環調節微鏡陣列Z方向俯仰角和微型反射鏡沿Z方向的位置，直至在信號收集系統中觀察到微鏡陣列沿著Z方向移動過程中，聚焦的熒光光斑不分離；

5)由信號收集系統進行收集，樣品不同深度的光片激發熒光信息成像于信號收集系統的不同位置，形成二維的樣品圖像；

6)經微鏡陣列系統后直接獲得的樣品圖像為一系列帶有條紋的光斑，即實驗結果，通過數據處理系統去除這些條紋；

7)同時白光照明系統發出白光照射至樣品的表面，觀測樣品；

8)壓電掃描系統對樣品進行沿垂直于軸向及數字激發光片的方向進行一維移動掃描，重復步驟1）~6），獲得整個三維熒光分布，從而得到樣品的三維分布。

2.如權利要求1所述的成像方法，其特征在于，在步驟1）中，調節貝塞爾光束產生系統與聚焦透鏡之間的距離，使得貝塞爾光束的軸向中心與激發物鏡的聚焦點重合，從而保證數字光片的均勻性。

3.如權利要求1所述的成像方法，其特征在于，在步驟6）中，將單個量子點取代樣品放置在激發物鏡焦平面處，數字激發光片激發單個量子點產生熒光，即單個量子點的光片激發熒光信息，經微鏡陣列系統后由信號收集系統收集，得到單個量子點的成像結果，作為點擴散函數，單個量子點的成像結果為具有條紋的光斑；數據處理系統通過利用單個量子點的成像結果作為點擴散函數，與實驗結果進行頻域解卷積處理，將由于微鏡陣列存在而帶來的條紋去除，從而使實驗結果更接近樣品的真實分布。