[發明專利]高產IgG1的重組菌及構建方法

在審

• 申請號: 202010169653.8
• 申請日: 2020-03-12
• 公開（公告）號: CN113388558A
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發明（設計）人: 宋浩;張金華
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/13;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

本發明公開了高產IgG1的重組菌及構建方法，利用合成生物學中的sRNA技術對大腸桿菌的糖酵解途徑和三羧酸循環途徑中基因表達進行微調，以提高IgG1抗體在大腸桿菌中的表達量。相較于以前的研究成果，目前缺少大腸桿菌的糖酵解途徑和三羧酸循環途徑對全長IgG1抗體表達影響的相關研究。本發明的重組菌可以提高IgG1的表達量；本發明的方法具有操作簡便，方便，為大腸桿菌規模化生產IgG1抗體提供了新思路。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，特別是涉及一種IgG1的重組菌及構建方法。

背景技術

2016年生物制藥市場營業額已達到2000億美元，這一極高的市場營業額主要來自單克隆抗體和抗體片段，治療性單克隆抗體占生物制藥市場總銷售額的40％以上。在已獲得美國FDA和歐洲EMEA批準的單克隆抗體中，免疫球蛋白G(IgG)占絕大多數，因此人們對IgG的生產最為關注。

Cetuximab(西妥昔單抗)是一種與表皮生長因子受體(EGFR)結合的嵌合IgG1，可以用于治療頭頸癌，轉移性結直腸癌和非小細胞肺癌。EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一，是原癌基因C-ERBB1的表達產物。EGFR可以在細胞核中積累聚集，并對細胞增殖、DNA修復、腫瘤發生、炎癥等產生影響。

目前，大多數IgG1抗體是在哺乳動物細胞系統中生產的。然而，由于糖基化的異質性、生產周期長，難以獲得高產細胞系等原因，哺乳動物生產IgG1的發展受到了限制。與哺乳動物細胞相比，大腸桿菌具有生長快速、成本低廉、分子操作簡單、可以實現高密度發酵等優勢，成為生產IgG1抗體的潛在熱門替代宿主。

糖酵解途徑和三羧酸循環途徑是大腸桿菌中碳源代謝的主要途徑。糖酵解途徑將葡萄糖轉化為3-磷酸甘油醛、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸和乙酰輔酶A，從而為細胞生物合成提供關鍵的前體和能量。三羧酸循環是一系列催化乙酰輔酶A轉化為二氧化碳的化學反應，用于釋放儲存的能量并為生物合成過程提供能量和某些氨基酸的前體。2003年發表在Metabolic Engineering期刊上的文獻The effects of alternate optimal solutionsin constraint-based genome-scale metabolic models.發現了大腸桿菌總是存在功能上相似的替代性代謝路徑。2014年發表在Plos Computational Biology期刊上的文獻Essential plasticity and redundancy of metabolism unveiledby syntheticlethality analysis.公開了大腸桿菌中存在的替代性代謝路徑用于增強環境變化前細胞的穩定性，但在特定的培養基條件下，一些代謝路徑不是必需的。

但是目前缺少大腸桿菌碳源代謝對全長IgG1抗體表達影響的相關研究。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種高產IgG1的重組菌。

本發明的第二個目的是提供一種高產IgG1的重組菌的構建方法。

本發明的技術方案概述如下：

高產IgG1的重組菌的構建方法，包括如下步驟：

(1)基因的體外合成和擴增

從NCBI數據庫獲得來源于人源的西妥昔單抗輕鏈的氨基酸序列和西妥昔單抗重鏈的氨基酸序列，將所述西妥昔單抗輕鏈簡稱LC，將所述西妥昔單抗重鏈簡稱HC；

將所述LC的氨基酸序列在JCAT網站，通過輸入：避免XbaI，NdeI，SpeI和HindIII限制性酶切位點為條件，得到優化后的LC；在優化后的LC的核苷酸序列5'、3'端分別加入NdeI限制性酶切位點和SpeI限制性酶切位點，得到加酶切位點的LC，在體外合成和擴增；