[發明專利]一種促中華絨螯蟹造血組織發育免疫增強劑的篩選模型構建方法

有效

• 申請號: 202010166678.2
• 申請日: 2020-03-11
• 公開（公告）號: CN111304146B
• 公開（公告）日: 2022-06-17
• 發明（設計）人: 呂孫建;張海琪;劉莉;袁雪梅;施偉達;杭小英
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12Q1/02;C12Q1/6888;A01K61/59
• 代理公司: 杭州知見專利代理有限公司 33295
• 代理人: 趙越劍

1.一種促中華絨螯蟹造血組織發育免疫增強劑的篩選模型構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：造血組織分離及鑒定

從待取樣中華絨螯蟹上剝離造血組織，經形態學觀察，鑒定并確定其為造血組織后再用于后續步驟；

步驟2：造血組織細胞及培養

將造血組織置于混合消化液中消化，經細胞篩過濾后離心，去除上清液后用L-15培養基重懸細胞，重復操作3遍后，用L-15培養基重懸獲得造血組織細胞懸浮液，計數后將細胞濃度調整至1×10⁵ cells/mL，置于24℃無CO₂恒溫培養箱中培養，連續觀察7日并拍攝每日細胞形態；

步驟3：免疫增強劑安全濃度測試

3.1將步驟2培養后的造血組織細胞濃度調整至1×10⁵cells/mL，并按200 μL/孔加入96孔板，置于24℃無CO₂恒溫培養箱中培養24h；

3.2選取待選免疫增強劑用L-15培養基溶解后，經0.22 μm濾膜過濾后備用；

3.3用L-15培養基對免疫增強劑進行對半稀釋，調整各免疫增強劑終濃度至100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.7 mg/mL、3.4 mg/mL、1.7 mg/mL和0.85 mg/mL；

3.4將3.1步96孔板中的培養液吸出，用L-15培養基清洗2遍，每孔加入200 μL梯度濃度的免疫增強劑，每個濃度3孔重復，于24℃無CO₂恒溫培養7天；

3.5每日收集1次細胞觀察并拍照，以3孔重復不出現細胞病變為安全濃度；

步驟4：免疫增強劑作用關鍵基因檢測

4.1根據中華絨螯蟹Astakine和Beta-actin基因設計熒光定量RT-PCR引物，于安全濃度的免疫增強劑作用細胞后的第1、2、3、4、5、6和7天，收集各孔細胞并提取RNA；

4.2采用反轉錄試劑盒將提取的RNA合成熒光定量PCR用cDNA第一鏈；

4.3接著進行熒光定量PCR檢測Astakine和Beta-actin基因的CT值，并用2^-△△Ct計算后確定不同免疫增強劑作用下Astakine基因的相對表達情況；

4.3步熒光定量PCR反應體系如下：

反應體系：20 μL，其中cDNA 5 μL，10 nM的上游引物和下游引物各1 μL，3 μL PCRgrade H₂O，10 μL SYBR Green Master；

4.3步熒光定量PCR反應條件如下：預變性95℃ 10 min；45 個循環的擴增，每個循環為：95℃變性10sec，60℃退火10 sec，72℃延伸30 sec；熔解曲線程序設置為95℃ 10 sec，65℃ 1 min，97℃ 1sec；

步驟5：免疫增強劑投喂

5.1制備含免疫增強劑的免疫增強型顆粒飼料和不含免疫增強劑的顆粒飼料；

5.2選擇幼蟹作為實驗對象，投免疫增強型顆粒飼料為試驗組，投不含免疫增強劑的顆粒飼料為對照組，每日按蟹體重的3%投免疫增強型顆粒飼料和不含免疫增強劑的顆粒飼料；

5.3于特定時間作如下分析：

5.3.1于投喂后的0、1、2、3、4和5周收集蟹造血組織，提取造血組織的RNA并用熒光定量RT-PCR檢測Astakine和Beta-actin基因的CT值，用2^-△△Ct計算Astakine基因的相對表達量；

5.3.2于投喂5周后完整剝離造血組織，并分別對造血組織及蟹體重進行稱量，計算造血組織體重比；

5.3.3取造血組織，經4%多聚甲醛固定和HE染色后，分析造血組織細胞團差異；

步驟6：急性攻毒實驗

取養殖5周后的蟹，放置于養殖桶中，注射100 μL 100 μg/mL的脂多糖，于注射后開始連續觀察7天并統計總死亡數量，計算死亡率；期間不投喂飼料，不換水；

Astakine基因的引物序列如下：

上游引物序列為：5’-GTGGTGGTGTTGGTGCTG-3’，

下游引物序列為：5’- ATGTCGTTGGGGTAGTGC-3’。