[發明專利]一種人胚胎干細胞源性的間充質干細胞的制備及其應用

在審

• 申請號: 202010164823.3
• 申請日: 2020-03-11
• 公開（公告）號: CN111454891A
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 曹哲厚;韋俊;王雪;鄭海剛;吳立前
• 申請（專利權）人: 杭州原生生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61P11/00
• 代理公司: 杭州橙知果專利代理事務所(特殊普通合伙) 33261
• 代理人: 李品

本發明公開了一種人胚胎干細胞源性的間充質干細胞的制備及其應用，屬于生物技術領域。解決了現有分化得到的hESC?MSCs純度不高等問題。一種人胚胎干細胞源性的間充質干細胞的制備方法，包括如下步驟：將胚胎干細胞用EDTA在培養箱中消化，再加入PBS中止消化，得到胚胎干細胞懸浮液，并將胚胎干細胞懸浮液中的胚胎干細胞分散成單個細胞，將分散后懸浮液離心；棄去步驟S01中離心后的液體的上清液，加入PBS重懸細胞，取PBS重懸細胞液離心；棄去步驟S02中離心后的液體的上清液，加入擬胚體培養液，再次重懸細胞，將重懸細胞液加入經過預處理的擬胚體培養孔板中，經離心后放入培養箱中培養，培養得到擬胚體；擬胚體在MSC分化培養基中貼壁培養10天后就可獲得hESC?MSC。本發明具有分化所需時間短，可快速獲得hESC?MSCs等優點。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其是涉及一種人胚胎干細胞源性的間充質干細胞的制備及其應用。

背景技術

干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。按照發育階段，干細胞可分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞來自囊胚期的內細胞團，具有無限增殖和三胚層分化潛能。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是屬于中胚層的一類多潛能干細胞，是最具代表性的成體干細胞之一，主要存在于結締組織和器官間質中，如骨髓、脂肪、臍帶、羊膜組織，間充質干細胞具有強大的增殖能力和免疫調節功能，在適宜的體內或體外環境下具有分化為肌細胞、肝細胞、成骨細胞、軟骨細胞、基質細胞等多種細胞的能力。間充質干細胞由于具備多向分化和免疫調節功能，因此在治療一些退行性和自身免疫性疾病等方面具有廣闊的臨床應用前景。國際干細胞協會對人MSCs的鑒定做了規定，要求滿足以下幾點。(1)MSCs在標準培養條件下能貼壁生長；(2)MSCs表達CD105、CD73和CD90，不表達CD45、CD14、CD34、HLA-DR、CD79a，其中CD105、CD73、CD90的陽性率應≥95％，其他陰性標志物的陽性率應≤2％；(3)MSCs在體外能向成脂細胞、成骨細胞及成軟骨細胞分化。

MSCs可以從骨髓、脂肪組織、外周血和臍帶血等不同的組織和器官里分離得到。從骨髓可以分離到較多的MSCs，但是需要通過做手術才能獲得，脂肪組織、外周血和臍帶血方便獲得，但是分離出的MSCs數量偏少，同時也會受到供體疾病、體質、年齡的影響，質量不可靠，數量也有限。因此從這些組織和器官分離MSCs并不是高效的方式。將人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)誘導分化為間充質干細胞(MSCs)，即人胚胎干細胞源性的間充質干細胞(human embryonic stem cell derived mesenchymal stem cells,hESC-MSCs)。hESC-MSCs與成體MSCs具有相似的生物學特性和功能，來源豐富，不產生畸胎瘤，均一性好。hESC-MSCs結合了hESCs和成體MSCs的優點，為臨床應用提供了充足的MSCs來源。

目前hESC-MSCs的誘導方法主要有三種：擬胚體誘導法、飼養層法及培養基直接誘導法。擬胚體誘導法是hESCs誘導分化的經典途徑，通過擬胚體的形成啟動分化過程，進而誘導獲得MSCs。然而，由于擬胚體內部分化不均一，導致MSCs的純化過程較長。飼養層法是將骨髓基質細胞系作為飼養層，誘導獲得MSCs細胞，然而，在誘導過程中，由于誘導MSCs與基質細胞具有類似的形態，因此分化過程不易觀察，獲得的細胞需通過流式細胞進行分選純化，增加了細胞的損失和實驗步驟，且獲得的細胞容易被動物源性成分污染，不利于hESC-MSCs的后期應用。培養基直接誘導法步驟簡單，可避免由于飼養層細胞的使用導致的細胞污染問題。然而，該誘導方法中血清濃度較高，不能很好地抑制其他成纖維樣細胞的分化，初始獲得的MSCs純度不高，需通過數次傳代或流式分選進行純化，延長了誘導時間(1-2個月)。因此，迫切需要能夠制備安全的、穩定的、具有高誘導效率的hESC-MSCs的制備方法。