[發明專利]檢測樹鼩TGF-β基因轉錄水平的實時熒光定量PCR的引物及方法

在審

• 申請號: 202010163306.4
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111139296A
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 王陳蕓;唐東紅;葉尤松;李哲麗;李濤;徐瑾;董鑫;張銘娟;黃明峰
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 于洪;陳左

1.一種用于非診斷目的檢測樹鼩TGF-β基因轉錄水平的實時熒光定量PCR的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟（1），分別以健康和待測樹鼩新鮮腎臟組織提取的總RNA為模板，逆轉錄合成得樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈；

步驟（2），建立樹鼩GAPDH基因及TGF-β基因標準曲線：以Easy dilution梯度稀釋步驟（1）得到的健康樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈，分別以未稀釋cDNA第一鏈及稀釋后的cDNA為模板，進行實時熒光定量檢測，并分別以TGF-β F和TGF-β R、GAPDH F和GAPDH R為特異性引物，進行實時熒光定量PCR擴增，分別得到健康樹鼩TGF-β基因、GAPDH基因的溶解曲線和擴增曲線；

步驟（3），以起始模板量拷貝數Log₁₀的對數值為X軸，以Ct值為Y軸進行繪制，分別得到GAPDH基因、TGF-β基因的標準曲線；

步驟（4），將步驟（1）得到的待測樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈分別以TGF-β F和TGF-β R、GAPDH F和GAPDH R為特異性引物，進行實時熒光定量PCR擴增，擴增體系和擴增程序與步驟（2）相同，分別得到待測樹鼩TGF-β基因、GAPDH基因的溶解曲線和擴增曲線；之后根據步驟（3）得到的標準曲線進行計算，得到樹鼩TGF-β基因轉錄水平；

所述的TGF-β F、TGF-β R、GAPDH F和GAPDH R引物序列如下：

TGF-β F：5＇-atatcaagcgcagtccccac-3＇；

TGF-β R：5＇-acagttctacgtgctgctcc-3＇；

GAPDH F：5＇-agccccatcaccatcttcc-3＇；

GAPDH R：5＇-aatgagccccagccttctc-3＇。

2.根據權利要求1所述的用于非診斷目的檢測樹鼩TGF-β基因轉錄水平的實時熒光定量PCR的方法，其特征在于，以Easy dilution梯度稀釋步驟（1）樹鼩腎臟組織cDNA第一鏈，梯度稀釋倍數分別為5倍、25倍、125倍、625倍。

3.根據權利要求1所述的用于非診斷目的檢測樹鼩TGF-β基因轉錄水平的實時熒光定量PCR的方法，其特征在于，實時熒光定量PCR擴增體系如下：

總計10μL。

4.根據權利要求1所述的用于非診斷目的檢測樹鼩TGF-β基因轉錄水平的實時熒光定量PCR的方法，其特征在于，實時熒光定量PCR擴增程序為：95℃預變性30s，95℃變性10s、60℃退火30s、共40個循環。