[發(fā)明專利]一種環(huán)境樣本非洲豬瘟病毒檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010162844.1
• 申請(qǐng)日: 2020-03-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111218527B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姬宏超;萬(wàn)艷娟;胡東雄;陽(yáng)享元
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州賽百純生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12Q1/6806
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

1.一種非疾病診斷目的的采用試劑盒檢測(cè)環(huán)境樣本非洲豬瘟病毒的方法，其特征在于，所述試劑盒包括特異性引物AP72-F和AP72-R，以及TaqMan探針AP72-P；所述探針的5′端標(biāo)記報(bào)告熒光染料為FAM，3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)為BHQ-1；其中特異性引物和TaqMan探針序列如下：

AP72-F：5’-TGCGATGATGATTACCTTTG-3’；SEQ?ID?NO：1；

AP72-R：5’-TGCTCTGGATACGTTAATATG-3’；SEQ?ID?NO：2；

AP72-P：5’-FAM-TTGGTATTCCTCCCGTGGCTT-3’-BHQ-1；SEQ?ID?NO：3；

所述試劑盒還包括環(huán)境樣本DNA提取純化試劑、擴(kuò)增反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；

所述環(huán)境樣本DNA提取純化試劑包括裂解液、裂解增強(qiáng)劑、去抑制劑因子、結(jié)合液、漂洗液、洗液、磁珠液、二氧化鋯珠、洗脫液；

所述裂解液包括181mM?Na₂HPO₄和121mM?GuHCl；所述裂解增強(qiáng)劑包括0.5M?SDS、10mMTris和20mM?EDTA；所述去抑制劑因子為133mM?Al³⁺；所述結(jié)合液包括5MGuHCl和體積濃度為10％Isopropanol；所述漂洗液為3M?GuSCN；所述洗液為50mM?Tris，pH為6.6；所述磁珠液中磁珠粒徑為1nm，磁珠液的濃度為50mg/ml；所述二氧化鋯珠的直徑為1mm；所述洗脫液為10mM?Tris，pH為8.5；

所述方法包括如下步驟：

(1)待測(cè)樣本DNA的提取；

提取步驟包括：(a)環(huán)境樣本處理：所述環(huán)境樣本取自養(yǎng)豬環(huán)境中的豬糞便、污泥、養(yǎng)殖飼料、土壤、豬舍食槽及食槽下方的食物殘?jiān)⒇i唾液、擦拭環(huán)境的抹布、拭子、豬尿液、養(yǎng)殖用水中的至少一種；

所述環(huán)境樣本處理的具體操作如下：

豬糞便、污泥、養(yǎng)殖飼料、土壤、豬舍食槽及食槽下方的食物殘?jiān)蜇i唾液的處理：取小于0.25g豬糞便、污泥、養(yǎng)殖飼料、土壤、豬舍食槽及食槽下方的食物殘?jiān)?50μl豬唾液加入研磨管中，加入750～900μl?S1-Lysis?Buffer渦旋、混勻；

擦拭環(huán)境的抹布或拭子的處理：取擦拭環(huán)境的抹布或拭子置于15ml或50ml離心管中，加入1ml?PBS緩沖溶液浸泡后，用鑷子擠壓抹布或拭子，取250μl液體至研磨管中，加入750μl?S1-Lysis?Buffer渦旋、混勻；

豬尿液或養(yǎng)殖用水的處理：使用負(fù)壓設(shè)備，配合抽濾裝置抽濾50ml～200mL的豬尿液或養(yǎng)殖用水，將抽濾裝置中的濾膜取出，用剪刀剪碎放入研磨管中，加入750μl?S1-LysisBuffer渦旋徹底、混勻；

所述S1-Lysis?Buffer為裂解液；

(b)將60μl?S2-Lysis?Enhancer溶液加入至步驟(a)處理后的樣品中，65℃孵育10min，渦旋震蕩10min，然后12000rpm離心5min，取400μl上清至1.5ml的離心管中；所述S2-LysisEnhancer為裂解增強(qiáng)劑；

(c)往步驟(b)所述的1.5ml的離心管中加入250μl?S3-Cleanup?Buffer，混勻，12000rpm離心2min，取上清液轉(zhuǎn)移至結(jié)合液中，將預(yù)封裝試劑板放入到核酸提取儀中，插入磁棒套，然后編輯核酸自動(dòng)提取儀，并啟動(dòng)運(yùn)行，待程序運(yùn)行25min結(jié)束后，將洗脫孔的核酸轉(zhuǎn)移至另一離心管中，進(jìn)行定量PCR檢測(cè)；所述S3-Cleanup?Buffer為清除液；所述預(yù)封裝試劑板中孔位試劑分布及試劑體積如下表所示，所述試劑體積的單位為μl；

(2)PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系設(shè)為25μl，在多個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)加入非洲豬瘟病毒擴(kuò)增反應(yīng)液20μl，將步驟(1)提取的待測(cè)樣本DNA5μl、陽(yáng)性對(duì)照5μl、陰性對(duì)照5μl分別加入不同的PCR反應(yīng)管中，混勻離心進(jìn)行PCR反應(yīng)；所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃10min，1個(gè)循環(huán)；95℃15s，55℃30s，40個(gè)循環(huán)；55℃結(jié)束時(shí)采集Fam熒光信號(hào)；

(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果與判定：通過(guò)檢測(cè)通道的Ct值進(jìn)行結(jié)果判定。