[發(fā)明專利]一種人工金屬酶及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010161626.6
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111229327B
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林英武;羅杰;杜可杰
• 申請（專利權(quán)）人: 南華大學(xué)
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C07K14/805;B01J31/22;C07H1/00;C07H21/04
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 劉偉

本申請屬于蛋白質(zhì)與生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種人工金屬酶及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明以肌紅蛋白為蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)骨架，在活性中心血紅素周圍引入谷氨酸，加入Mg^II離子，形成金屬離子?蛋白質(zhì)復(fù)合物Mg^II?L29E Mb，構(gòu)建了一種新型的人工金屬酶。本發(fā)明所述Mg^II?L29E Mb復(fù)合物能連續(xù)水解DNA分子中的磷酸二酯鍵，最終降解DNA分子，從而類似于天然核酸外切酶性質(zhì)，具有DNA外切酶活性，能快速降解DNA分子，最終實(shí)現(xiàn)DNA完全降解。降解的DNA底物分子具有廣譜性，包括線性DNA或環(huán)狀DNA分子。而且，這一催化活性是野生型Mb或單獨(dú)L29E Mb蛋白以及Mn^II(或Co^II)?L29E Mb復(fù)合物所不具有的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)與生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人工金屬酶及其制備方法與應(yīng)用，尤其是一種基于鎂離子-肌紅蛋白突變體復(fù)合物的人工金屬酶及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)作為生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，參與體內(nèi)所有關(guān)鍵活動。據(jù)研究，約1/3蛋白質(zhì)與特定金屬離子結(jié)合來維持其結(jié)構(gòu)和生物功能，這類蛋白稱之為金屬蛋白。在過去的幾十年，基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，血紅素蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)逐漸被人們所關(guān)注，蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)有助于揭示血紅素蛋白的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。

肌紅蛋白(Myoglobin，Mb)常作為血紅素蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)骨架，它具有分子量小、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，易獲得高純度蛋白和晶體結(jié)構(gòu)等。以Mb為模板，通過設(shè)計(jì)調(diào)控血紅素活性中心微環(huán)境，可設(shè)計(jì)獲得各種人工金屬蛋白酶。

基于基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展，運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)可以研究特定氨基酸殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和性質(zhì)中的作用。

金屬酶的活性部位一般都含有兩個或多個協(xié)同作用的金屬離子，這些金屬蛋白的金屬中心一般都具有獨(dú)特的配位方式和配位集合結(jié)構(gòu)，而正是由于配位后的這種特殊的結(jié)構(gòu)和排列，使金屬蛋白和金屬酶具有特殊的功能和活化中心。天然金屬酶的高催化活性，歸因于其活性中心金屬離子與周邊的氨基酸殘基的協(xié)同作用。因此，模擬天然金屬蛋白和金屬酶中的多核活性中心結(jié)構(gòu)，能夠合成具有降解核酸功能的人工金屬水解酶。

申請人前期申請的申請?zhí)枮?01810251841.8.，發(fā)明名稱為一種基于金屬離子-肌紅蛋白突變體復(fù)合物的人工金屬水解酶的制備及應(yīng)用的中國專利中，專利提到了錳離子Mn(^II)和鈷離子(^II)與L29E Mb形成的Mn^II(或Co^II)-L29E Mb復(fù)合物。但該兩種復(fù)合物只具有DNA內(nèi)切酶活性，不具有外切酶活性，即只能將DNA切割成線狀和開環(huán)缺口狀態(tài)，而不能降解DNA。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種具有外切酶活性，能快速降解線性或環(huán)狀DNA分子的人工金屬酶。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種人工金屬酶，包括肌紅蛋白突變體和金屬離子，所述肌紅蛋白突變體為L29EMb氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述金屬離子為Mg^II。

本發(fā)明所述肌紅蛋白突變體是在野生型肌紅蛋白(Mb)的氨基酸序列中，第29位氨基酸由異亮氨酸(L)突變?yōu)楣劝彼?E)得到突變體蛋白L29E Mb，其氨基酸序列為：VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDIEIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASEDLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRHPGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG。