[發(fā)明專利]檢測非洲豬瘟病毒的引物對、探針、試劑盒、及其應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010161384.0 | 申請日： | 2020-03-10 |
| 公開（公告）號： | CN113373261A | 公開（公告）日： | 2021-09-10 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 陳鴻軍;錢鶯娟;扈榮良;鄭龍三;薛峰;戴建君;吳曉東;朱鴻飛;郭曉宇;王振忠 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心上海分中心） |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 上海序倫律師事務(wù)所 31276 | 代理人： | 周東萍 |
| 地址： | 200241 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 檢測 非洲 豬瘟 病毒 引物 探針 試劑盒 及其 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明公開了一種檢測非洲豬瘟病毒的引物對、探針、試劑盒，所述試劑盒包含針對SEQ ID NO：1所示非洲豬瘟病毒MGF360?13L基因序列或其部分序列設(shè)計的引物對和探針。本發(fā)明的檢測非洲豬瘟病毒的試劑盒，能快速、準確地對非洲豬瘟病毒(ASFV)進行檢測，靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好，具有廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于MGF360-13L基因檢測非洲豬瘟病毒的引物對、探針、試劑盒、及其應(yīng)用。
背景技術(shù)
非洲豬瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine FeverVirus,ASFV)感染引起的一種豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病。臨床上主要以高熱皮膚和內(nèi)臟器官出血、共濟失調(diào)和食欲廢絕為主要特征，死亡率接近100％。非洲豬瘟是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)要求法定報告的動物疫病，我國動物病原微生物名錄將其列為一類病。自2018年8月3日中國農(nóng)村農(nóng)業(yè)部在遼寧省確認非洲豬瘟疫情以來，非洲豬瘟已蔓延至32個省級行政區(qū)域，使得近120萬頭生豬遭到撲殺，對中國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重威脅畜牧業(yè)的健康發(fā)展，也給人類公共衛(wèi)生造成了威脅。ASFV屬于非洲豬瘟病毒科，非洲豬瘟病毒屬，是該科的唯一成員。ASFV基因組大小170～190kb，是一種雙股DNA病毒，編碼160～175個基因。用編碼VP72蛋白的B646L基因分析不同地區(qū)ASFV分離株，可以將ASFV流行株分為22個主要的基因型，其中流行于中國的主要是基因II型。
目前針對ASFV的檢測技術(shù)主要分為兩大類，即基于病毒抗體的免疫學檢測方法和基于病毒核酸的PCR檢測技術(shù)。針對ASFV的免疫學檢測方法主要有紅細胞吸附試驗(HA)、直接熒光抗體試驗(FAT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等。免疫學檢測方法的優(yōu)點在于可以準確反應(yīng)病毒的發(fā)生和發(fā)展情況。但是，免疫學檢測方法試驗要求高、費用高、耗時長、敏感性較低。此外，ASFV感染早期并不會產(chǎn)生抗體，因此免疫學檢測方法的使用受到了局限。近年來，熒光定量PCR由于敏感性高、特異性好、耗時短及定量準確等優(yōu)點而逐漸被廣泛應(yīng)用。熒光定量PCR主要包括SYBR Green I法和TaqMan探針法，TaqMan探針法相對于SYBR Green I法具有更高的特異性，應(yīng)用價值更高。
ASFV基因組龐大，其基因組中約30％的開放閱讀框存在多個拷貝，即多基因家族(Multigene families,MGFs)，包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505(在Malawi分離株中命名為530)。MGF編碼的多個拷貝提示病毒的選擇進化可能與此相關(guān)。雖然對MGFs的功能尚待深入研究，但研究已證明MGF在病毒的感染過程中有重要作用。敲除ASFV強毒或弱毒株MGF360和530/505的某些基因?qū)?dǎo)致病毒在巨噬細胞或軟蜱體內(nèi)的復(fù)制效率下降，免疫動物后可以提供針對同源病毒或部分異源病毒的保護力；缺失MGF360的10L、11L、12L、13L、14L和MGF530/505-1R、-2R、-3R基因的弱毒株OURT88/3，在體內(nèi)和體外均可激發(fā)較高水平的IFN(Interferon)表達，這種缺失毒株可以對某些基因型提供一定的攻毒保護能力；除此之外，同樣缺失ASFV Benin 97/1毒株的上述基因，并使MGF360-9L與MGF 505-4R失活，以此缺失毒株感染豬巨噬細胞可檢測到IFN-β的表達水平較原始毒株明顯升高，而以這種缺失毒株免疫豬后可以提供一定的免疫保護，且這種保護還與病毒毒力成劑量相關(guān)。這些都說明MGF360家族有很大的研究價值，有必要建立針對MGF360家族的檢測方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決目前缺乏快速、準確檢測非洲豬瘟病毒試劑盒的技術(shù)問題，提供一種熒光定量RT-PCR檢測非洲豬瘟病毒的引物對、探針、及試劑盒，該試劑盒能快速、準確、靈敏、特異地對非洲豬瘟病毒(ASFV)進行檢測。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
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