[發明專利]用于細胞內重組蛋白固定的三角形網狀RNA支架及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202010161002.4
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111378654B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 林建強;柴玉穎;任一林;孫煦茵;溫鑫;林建群
• 申請（專利權）人: 山東大學;青島龍鼎生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/115;C12N15/70
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

本發明公開了一種用于細胞內重組蛋白固定的三角形網狀RNA支架，由二維的三角形網狀RNA支架與可選擇施加的適配體序列組成；其中所述RNA支架會指導相互作用的酶之間的亞層流動，限制交叉作用并提高順序代謝反應的產量。本發明還公開了所述的用于細胞內重組蛋白固定的三角形網狀RNA支架在細胞內固定核糖醇脫氫酶和甲酸脫氫酶中的應用，實驗證實本發明方法構建的工程菌阿洛醇的產量能從3.036g/L提高到4.433g/L，有望在工業生產中，以節約成本，提高酶促反應效率的優勢，最大化地提高產物的產量，經濟價值和應用前景廣闊。

技術領域

本發明涉及一種用于細胞內重組蛋白固定的三角形網狀RNA支架及其構建方法與應用。屬于生物化工領域。

背景技術

傳統化工和制藥行業存在高能耗、高物耗、高污染和高排放等缺陷，對資源和環境帶來嚴重挑戰。生物催化具有節能、降耗、低污染、低排放等環境友好特點，可替代傳統化工、制藥工藝，實現產業轉型升級，促進綠色發展。生物催化中，與酶催化相比細胞催化具有無需進行細胞破碎、酶的分離純化、酶在細胞內具有更加穩定、回收方便、成本低、工藝簡單等諸多優勢。細胞催化是將催化酶基因(或多酶基因)在細胞重組細胞內表達，利用重組細胞進行生物催化合成高附加值產品的技術。

對于細胞催化，重組細胞性能對催化結果有重要影響。首先，重組細胞內構建的人工合成途徑與細胞天然途徑之間存在相互干擾；其次，對于涉及多個酶的人工合成途徑，重組酶分子在細胞內隨機分布，則各種代謝中間物需要在不同酶分子之間不斷互相擴散才能完成整個催化過程，不僅導致代謝物的串擾還導致時間延遲和酶分子周圍底物濃度降低和酶反應速率降低。

在天然狀態下，酶分子在細胞空間內是有序分布的，從而使細胞內各種復雜的生化反應順利進行，互不干擾。

合成生物學技術為工程菌株的改造和完善提供了有利的工具。利用合成生物學技術在細胞內構建人工支架，將重組酶定位于人工支架上形成人工代謝硫通路，則可以解決重組細胞存在的上述問題：減少或克服串擾問題；縮短細胞內擴散距離減少擴散時間延遲；提高酶分子周圍局部底物濃度，加快反應速度。

目前細胞內分子支架分蛋白支架和核酸支架，后者又分DNA支架和RNA支架。從細胞合成經濟性上考慮，蛋白合成首先需要DNA和RNA的合成，因此蛋白支架經濟性較低；核酸支架在能量和材料消耗上更具有優勢。雖然DNA支架相對于RNA支架不易被降解，但由于非編碼RNA具有單鏈結構，經過精心設計后可以部分相互配對，互相連接，組成結構復雜的線性、平面甚至立體結構，因而具有更大的靈活性。但是目前RNA支架主要是線性結構，RNA支架的穩定性不高，RNA支架錨定的重組蛋白分子的數量較少，為了增加RNA支架結構密度和錨定蛋白分子的密度以提高反應速率，構建三角形平面網狀RNA支架，以提高重組細胞的催化性能成為必然。經檢索，目前有關構建三角形平面網狀RNA支架的專利還未見報道

發明內容

針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種用于細胞內重組蛋白固定的三角形網狀RNA支架及其構建方法與應用。

本發明所述的用于細胞內重組蛋白固定的三角形網狀RNA支架，由二維的三角形網狀RNA支架與可選擇施加的適配體序列組成；其特征在于：所述二維的三角形網狀RNA支架是以單鏈RNA為元件，并以3',5'-磷酸二酯鍵連接SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3所示單鏈RNA的核苷酸序列構成回文序列在細胞內形成三角形支架單元(見圖1)，該三角形支架單元中的每條SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示單鏈RNA的核苷酸序列又分別與相鄰的三角形支架單元中與之完全相同的單鏈RNA的核苷酸序列根據堿基配對形成RNA雙鏈，并以此方式不斷配對形成RNA雙鏈，在細胞內構成了空間上呈二維的三角形網狀RNA支架(見圖2)；所述可選擇施加的適配體序列是指能特異性識別病毒外殼蛋白的序列。