[發(fā)明專利]一種用于檢測新型冠狀病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010160702.1
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111270012B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設計）人: 李浩;寇志華;孫巖松;周育森;董雪;王彥賀;何雷;趙忠鵬;孫世慧;谷宏婧
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫(yī)學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6804;C12Q1/6844;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 白艷

本發(fā)明公開了一種用于檢測新型冠狀病毒(2019?nCoV)的CRISPR核酸檢測試劑盒。本發(fā)明提供一種用于檢測新型冠狀病毒的試劑盒，包括用于檢測新型冠狀病毒的CRISPR?Cas13a系統(tǒng)和與其配套使用的側向流試紙；a1)單獨包裝的crRNA和LwCas13a蛋白；a2)報告RNA，其由20個U組成；a3)用于擴增待測樣本靶點序列的RT?RAA擴增引物，且所述RT?RAA擴增引物中的一條引物的5'末端具有被T7 RNA聚合酶識別的區(qū)域；本發(fā)明的CRISPR核酸檢測試紙可通過CRISPR?Cas13a系統(tǒng)實現(xiàn)對新型冠狀病毒核酸的高靈敏、高特異、便捷檢測，靈敏度達到10copies/test。

技術領域

本發(fā)明涉及一種用于檢測新型冠狀病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸檢測試劑盒，屬于分子診斷技術領域。

背景技術

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由新型冠狀病毒(2019-nCoV)引起、導致人類發(fā)生急性感染的乙類傳染病，具有傳染性強、臨床救治 能力薄弱、無批準上市的特效藥物及無疫苗預防的特點。新型冠狀病毒的檢測技術包 括病毒基因測序、IgM和IgG抗體的檢測、熒光定量PCR、恒溫擴增芯片核酸檢測技 術等。然而現(xiàn)有檢測技術均存在一定的不足，膠體金法簡單便攜，但靈敏度不足；包 括LAMP、RPA在內的恒溫擴增法靈敏度很高，但在操作過程中易污染；熒光定量PCR法 和病毒基因測序穩(wěn)定、可靠、具有一定的靈敏度，但樣本處理復雜，且對儀器要求高。

2017年4月，美國研究人員建立了一種靈敏度達到埃摩級(單拷貝)，特異性達 到單堿基的核酸檢測技術——基于CRISPR-Cas13a的核酸檢測平臺SHERLOCK(Specific HighSensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)，利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白(LwCas13a)的非特異剪切活性，結合可以高效擴增目的片段的重組聚合酶擴增技術(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，實現(xiàn)了對痕量核酸快速、廉價、高 靈敏的檢測。2018年4月，美國研究人員將以上技術運用到社區(qū)現(xiàn)場檢測中，發(fā)明了 一種側向流試紙，通過顯線法顯示目的核酸的存在，使此技術更加便捷。

發(fā)明內容

本發(fā)明一個目的是提供一種用于檢測新型冠狀病毒的試劑盒。

本發(fā)明提供的試劑盒，包括用于檢測新型冠狀病毒的CRISPR-Cas13a系統(tǒng)和與其配 套使用的側向流試紙；

所述用于檢測新型冠狀病毒的CRISPR-Cas13a系統(tǒng)包括如下a1)-a3)；

a1)單獨包裝的crRNA和LwCas13a蛋白(氨基酸序列為序列6)，或crRNA和LwCas13a蛋白復合體；

所述crRNA的靶點序列為序列1；

a2)報告RNA，其由20個U組成，且所述報告RNA的序列兩端分別標記FAM和生物素；

a3)用于擴增待測樣本靶點序列的RT-RAA擴增引物，且所述RT-RAA擴增引物中的一條引物的5'末端具有被T7 RNA聚合酶識別的區(qū)域；

所述側向流試紙依次包括樣品板(含有加樣孔)、與納米金抗FITC抗體、鏈親和素線、抗體捕獲線和吸收板；

所述抗體捕獲線包被的抗體為羊抗兔IgG。

更進一步的，所述CRISPR-Cas13a系統(tǒng)還包括用于特異性擴增新型冠狀病毒靶點序列的其他試劑，所述用于特異性擴增新型冠狀病毒靶點序列的其他試劑包括如下試 劑中的全部或部分：NTP(如NTP Mix)、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制劑、MgCl₂溶液、 HEPES緩沖液、RNase free water，具體見實施例中的表7中組分。