[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)格特隱球菌的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010159845.0
• 申請(qǐng)日: 2020-03-10
• 公開（公告）號(hào): CN111763756A
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京成實(shí)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11724
• 代理人: 陳永虔

本發(fā)明屬于真菌病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種快速檢測(cè)格特隱球菌的方法，其包括如下步驟：步驟1）選擇待測(cè)樣本；步驟2）提取格特隱球菌DNA；步驟3）制備實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系；步驟4）熒光PCR擴(kuò)增。本發(fā)明能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出格特隱球菌，靈敏度和特異性較高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于真菌病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種準(zhǔn)確檢測(cè)格特隱球菌的方法。

背景技術(shù)

隱球菌是一種病菌，可導(dǎo)致隱球菌病。媒介一般為干的鴿子糞，鮮有人與人之間傳播的報(bào)告。尚無特效藥，一般進(jìn)行對(duì)癥處理。隱球菌病是由隱球菌引起的肺部或播散性感染性疾病，主要引起肺炎和腦膜炎，也引起皮膚、骨骼或內(nèi)臟器官感染。臨床上結(jié)合臨床表現(xiàn)以及顯微鏡檢查結(jié)果進(jìn)行診斷，再通過真菌培養(yǎng)或組織染色加以確認(rèn)。臨床上治療藥物包括兩性霉素B、三唑類抗真菌藥物和氟胞嘧啶^。

隱球菌屬目前確定的總類一共有37種，其中新生隱球菌和格特隱球菌致病力較強(qiáng)。此前，隱球菌病多為新生隱球菌所致，鮮有格特隱球菌致病的報(bào)道。近10年來，關(guān)于格特隱球菌病的報(bào)道逐漸增多。格特隱球菌之前被認(rèn)為是新生隱球菌的格特變種(血清型B和C)，直到2002年被確立為一個(gè)獨(dú)立的物種。和新生隱球菌以及其他真菌病原體一樣，格特隱球菌可以從土壤以及腐爛的有機(jī)材料中分離得到，通過擔(dān)孢子或隱球菌酵母細(xì)胞的吸入感染宿主引起肺炎，經(jīng)過2-11個(gè)月的潛伏期后可以播散和演變?yōu)槟X膜炎，未經(jīng)治療的免疫功能不全的患者潛伏期可能更長。新生隱球菌僅以所有感染免疫缺陷宿主為感染對(duì)象，而格特隱球菌以熱帶和亞熱帶地區(qū)的免疫功缺陷宿主為感染對(duì)象，除此之外，其臨床表現(xiàn)、治療藥物以及預(yù)后均有所不同。

隱球菌病的診斷通常依靠直接鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)臨床樣本或檢測(cè)體液中的隱球菌抗原。臨床標(biāo)本常規(guī)染色可以發(fā)現(xiàn)隱球菌，印度墨汁染色可以識(shí)別痰或腦脊液中的隱球菌但敏感性低。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)或乳膠凝技術(shù)檢測(cè)血液中的隱球菌比直接鏡檢更為敏感。國內(nèi)已建立了ABC-ELISA法、免疫放射測(cè)定法用于檢測(cè)新生隱球菌抗原，而且特異性和敏感性較高。然而，這些臨床微生物實(shí)驗(yàn)室難以明確菌種，培養(yǎng)是目前較為常用的可靠的區(qū)分格特隱球菌和新生隱球菌的方法。最簡單的確定格特隱球菌的方法是把隱球菌分離到刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚藍(lán)培養(yǎng)基中培養(yǎng)：格特隱球菌在培養(yǎng)基上生長并使菌落周圍的培養(yǎng)基成為藍(lán)色。

通過培養(yǎng)進(jìn)行區(qū)分格特隱球菌和新生隱球菌的方法工作效率較低，耗費(fèi)時(shí)間長，而且人力物力消耗很大，存在較大的局限性。核酸檢測(cè)快速便捷，是近年來檢測(cè)病原體的發(fā)展趨勢(shì)。文獻(xiàn)“新生隱球菌格魯比變種、新生變種和格特隱球菌的多重聚合酶鏈反應(yīng)鑒定，馮曉博 《中華皮膚科雜志》 2012年” 建立了一種基于核糖體基因內(nèi)間隔區(qū)（IGS）的多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），用于快速鑒定新生隱球菌新生變種、格魯比變種和格特隱球菌，該方法需要針對(duì)每一種菌設(shè)計(jì)引物，方法比較繁瑣，反應(yīng)不夠快捷；專利“CN2017101725670”公開了一種檢測(cè)并鑒定隱球菌的靶基因、引物和探針及試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)真菌學(xué)的領(lǐng)域。根據(jù)隱球菌的靶基因，設(shè)計(jì)該檢測(cè)隱球菌基因的引物序列如SEQ ID No.3與SEQ ID No.4和/或SEQID No.6與SEQ ID No.7所示，其中SEQ ID No.3與SEQ ID No.4對(duì)應(yīng)于新生隱球菌，SEQ IDNo.6與SEQ ID No.7對(duì)應(yīng)于格特隱球菌，可以在同一體系中用于特異性檢測(cè)新生隱球菌與格特隱球菌兩種隱球菌”，該方法只是將特異性擴(kuò)增新生隱球菌和格特隱球菌引物和檢測(cè)探針進(jìn)行組合，創(chuàng)新性相對(duì)較低，而且兩套擴(kuò)增引物，成本更高，擴(kuò)增反應(yīng)相對(duì)繁瑣。

因此，需要新的技術(shù)和方法來正確檢測(cè)并鑒定格特隱球菌。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了克服傳統(tǒng)檢測(cè)格特隱球菌的操作繁瑣、靈敏度低、錯(cuò)誤率高等缺陷，提供一種準(zhǔn)確檢測(cè)格特隱球菌的方法，該方法可以是診斷目的，也可以是非診斷目的。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。

一種快速檢測(cè)格特隱球菌的方法，其包括如下步驟