[發明專利]一種用于植物根腐病進行基因功能驗證的方法

在審

• 申請號: 202010159691.5
• 申請日: 2020-03-10
• 公開（公告）號: CN111187788A
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發明（設計）人: 于明
• 申請（專利權）人: 于明
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N1/14;A01H5/00;A01H6/54;C12R1/645;C12R1/77
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種用于植物根腐病進行基因功能驗證的方法，該方法包括如下步驟：一、構建表達載體；二、獲得AANAT基因表達的轉基因大豆幼株；三、將原大豆幼株和轉基因大豆幼株分別在相同培養液中培養得原培養液和轉基因培養液；四、制備立枯絲核菌培養基A1組和A2組，鐮刀菌培養基B1組和B2組；五、將原培養液分別加入培養基A1組和培養基B1組，取轉基因培養液分別加入培養基A2組和培養基B2組；六、將步驟五培養基分別培養后，置于顯微鏡下分別觀察對比。本發明方法便于更直觀準確的研究AANAT基因與根腐病之間的聯系，且避免了特殊實驗失誤影響菌落生長，使實驗數據更準確，驗證結果更接近實際。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，更具體地說，本發明涉及一種用于植物根腐病進行基因功能驗證的方法。

背景技術

根腐病是一種真菌引起的病，該病會造成根部腐爛，吸收水分和養分的功能逐漸減弱，最后全株死亡，主要表現為整株葉片發黃、枯萎。

發病時間一般多在3月下旬至4月上旬，5月進入發病盛期。

主要危害幼苗，成株期也能發病。發病初期，僅僅是個別支根和須根感病，并逐漸向主根擴展，主根感病后，早期植株不表現癥狀，后隨著根部腐爛程度的加劇，吸收水分和養分的功能逐漸減弱，地上部分因養分供不應求，新葉首先發黃，在中午前后光照強、蒸發量大時，植株上部葉片才出現萎蔫，但夜間又能恢復。病情嚴重時，萎蔫狀況夜間也不能再恢復，整株葉片發黃、枯萎。此時，根皮變褐，并與髓部分離，最后全株死亡。該病常與漚根癥狀相似，屬真菌病害。病菌在土壤中和病殘體上過冬，發病的根莖一般多在3月下旬至4月上旬發病，5月進入發病盛期，其發生與氣候條件關系很大。苗床低溫高濕和光照不足，是引發此病的主要環境條件。育苗地土壤粘性大、易板結、通氣不良致使根系生長發育受阻，也易發病。另外，根部受到地下害蟲、線蟲的危害后，傷口多，有利病菌的侵入。在此環境下，不僅采取播種、扦插的草本花卉易受害，采取扦插、分株、壓條繁殖的月季、木芙蓉、扶桑等木本花卉也易發病。

發病原因:

1、所栽植樹種對立地條件不適應而發病:地勢低洼，土壤粘重，排水不良;

2、管理不當:土壤板結，透氣性不好，造成根系呼吸困難受阻，根部積水腐爛;

3、地下害蟲危害或栽植傷口沒處理好，傳染病菌從傷口侵 入，使根系發病。此病可由腐霉、鐮刀菌、疫霉等多種病原侵染引起。病菌在土壤中或病殘體上越冬，成為翌年主要初侵染源，病菌從根莖部或根部傷口侵入，通過雨水或灌溉水進行傳播和蔓延。地勢低洼、排水不良、田間積水、連作及棚內滴水漏水、植株根部受傷的田塊發病嚴重。年度間春季多雨、梅雨期間多雨的年份發病嚴重。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于針對上述細菌（尤其是立枯絲核菌和鐮刀菌）導致植物根腐病的不足，提供一種用于植物根腐病進行基因功能驗證的方法，分別通過對原大豆幼株和轉基因大豆幼株培養而得兩種培養液，分別觀察分析這兩種培養液對立枯絲核菌和鐮刀菌的生長抑制狀況，便于準確的研究 AANAT基因與根腐病之間的聯系。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是，一種用于植物根腐病進行基因功能驗證的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

步驟一、構建含目的基因AANAT的大豆核表達載體Rhizoctonia solaniFusarium-aanat；

步驟二、將步驟一中的所述核表達載體Rhizoctonia solaniFusarium-aanat導入原大豆細胞核基因組中，篩選獲得AANAT基因表達的轉基因大豆幼株；

步驟三、選取原大豆幼株和步驟二中所述的轉基因大豆幼株，將所述原大豆幼株和轉基因大豆幼株分別在相同培養液中培養，分別得原培養液和轉基因培養液；

步驟四、制備立枯絲核菌培養基A1組和A2組，制備鐮刀菌培養基B1組和B2組；