[發明專利]一種檢測牛奶中慶大霉素殘留方法

在審

• 申請號: 202010157221.5
• 申請日: 2020-03-09
• 公開（公告）號: CN111323592A
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 王永智;雷高新;葉華躍;喬正;邱文娜;陳凌;彭福中;吳宏斌
• 申請（專利權）人: 江蘇華泰疫苗工程技術研究有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/53
• 代理公司: 南京常青藤知識產權代理有限公司 32286
• 代理人: 仲暉

本發明提供一種檢測牛奶中慶大霉素殘留方法，具體涉及檢測技術領域，S1、以10mM pH4.5的醋酸鈉溶液溶解BSA?GM至100μg/ml,以1XHBS溶液為上樣緩沖液進行BSA?GM的偶聯固定。S2、樣品處理，將牛奶以1*HBS緩沖液進行稀釋；以醋酸將稀釋后的牛奶pH值調至4.6,使酪蛋白沉淀出來；離心取上清液；將上清液用微孔濾膜過濾，即得牛奶樣品溶液；S3、進行標準曲線建立將以1*HBS緩沖液稀釋配制好不同濃度的慶大霉素對照品溶液加入至5μg/ml慶大霉素單克隆抗體溶液；然后進行室溫孵育1.5小時后上樣檢測，做標準曲線；S4、樣品檢測：將樣品加至5μg/ml慶大霉素單克隆抗體溶液孵育1.5小時后進行檢測；按照S3步驟中的標準曲線計算慶大霉素含量。本發明具有檢測快速、免標記、實時分析、檢測通量高等優點。

技術領域

本發明屬于檢測技術領域，具體涉及一種檢測牛奶中慶大霉素殘留方法。

背景技術

慶大霉素(Gentamicin)是一種重要的氨基糖苷類抗生素，最早于1963年由Weinstein等人分離獲得。慶大霉素具有抗菌活性強、抗菌譜廣、抗菌活性高等特點。慶大霉素抗菌活性的機理為通過結合細菌核糖體30S亞基16S rRNA上的氨酰基位點干擾病原菌蛋白翻譯過程，阻斷病原菌蛋白質的合成從而將其殺死。因慶大霉素價格低廉且易得，被廣泛的應用各種禽畜疾病的治療，甚至作為畜禽飼料添加劑以達到防治畜禽疾病的目的^[5]。慶大霉素在禽畜養殖中的過量使用會引起禽畜產品中慶大霉素的殘留、蓄積，如在泌乳動物的乳汁中的殘留。禽畜產品中抗生素的殘留不僅影響產品的品質^[5-8]，更嚴重的是，含慶大霉素殘留的禽畜產品勢必會給人們的身體健康帶來潛在危害，長期食用含慶大霉素殘留的食品，則會導致慶大霉素在人體內的蓄積而引發對人體的毒性作用。慶大霉素對人體的主要毒害主要表現為耳毒性和腎毒性^[10]。耳毒性主要表現為前庭損害、耳蝸神經損害、眩暈、聽力減退,甚至耳聾，嚴重的腎毒性則可致腎衰竭。除此之外，慶大霉素作為人畜共用藥物，長期食用含有慶大霉素殘留的禽畜產品，易誘導人體致病菌產生耐藥性。為嚴格控制慶大霉素在禽畜產品中的殘留，保證食品安全，各國食品監管機構均制定了動物性食品中慶大霉素的最大殘留限量，歐盟規定慶大霉素牛奶中的最大殘留限量(maximum residuelimit，MRL)100μg/kg，中國農業部《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定慶大霉素在牛奶中的最大殘留量為200μg/kg^]。

慶大霉素殘留的檢測方法主要有：微生物法、免疫學分析法、理化分析法。微生物法是利用慶大霉素微生物生長的抑制作用,對樣品中慶大霉素殘留進行定性或定量分析。微生物法對設備要求較低，且具有方法簡單、操作方便等優點，是慶大霉素殘留檢測廣泛采用的方法。但微生物法存在靈敏度低、實驗周期長、方法穩定性差、結果判斷誤差大且易受到樣品雜質的影響等缺點。慶大霉素殘留檢測的儀器分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、液質聯用法(HPLC-MS)、毛細管電泳法等，儀器分析方法靈敏度高、精確度高，但儀器分析法樣品前處理(如需柱前衍生)復雜,設備及技術要求較高、分析速度慢、檢測通量小，因此限制了儀器分析法在食品慶大霉素殘留檢測中的大規模應用。免疫分析方法主要包括酶聯免疫法、熒光膠體金法、放射免疫法、免疫傳感器及蛋白芯片法。免疫分析方法特異性強、靈敏度高、操作簡單、檢測速度快，分析成本低，在慶大霉素殘留檢測中得到了廣泛的應用。免疫分析法是將抗原抗體特異性的免疫反應與酶化學反應或其他理化檢測方法進行聯用，以提高檢測靈敏度。免疫分析法與其他技術的聯用也是慶大霉素殘留檢測技術發展的一個重要方向。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測牛奶中慶大霉素殘留方法，將SPR技術的檢測快速、免標記、實時分析、檢測通量高等優點與抗體抗原反應的高特異性、高靈敏性結合起來，可用于牛奶中慶大霉素殘留的高通量快速測定。

本發明提供了如下的技術方案：

一種檢測牛奶中慶大霉素殘留方法，其具體步驟如下：