[發明專利]一種評估干細胞免疫調控功能的方法

有效

• 申請號: 202010156994.1
• 申請日: 2020-03-09
• 公開（公告）號: CN111235209B
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發明（設計）人: 趙汝星;侯新國;陳麗
• 申請（專利權）人: 山東大學齊魯醫院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 深圳舍穆專利代理事務所(特殊普通合伙) 44398
• 代理人: 黃賢炬

1.一種評估干細胞制劑免疫調控功能的方法，其特征在于，包括以下步驟：

分選將接受干細胞制劑的受體的效應細胞，所述效應細胞為CD4⁺CD25^-T細胞；

采用抗體包被的擴增磁珠，對所述分選后的效應細胞進行標準化的效應細胞擴增，所述擴增磁珠為抗人CD3抗體、CD28抗體預包被的磁珠；

基于CFSE染色標記所述擴增后的效應細胞，得到CFSE標記效應細胞；

將所述CFSE標記效應細胞與待檢測干細胞制劑混合培養，所述混合培養過程包括：將待檢測干細胞制劑單細胞混懸液加入接種有所述CFSE標記效應細胞的孔板的3個復孔作為檢測孔；將所述擴增后未經CSFE標記的效應細胞的單細胞混懸液加入接種有所述CFSE標記效應細胞的孔板的另外3個復孔作為對照孔，混勻后培養；培養條件為：37℃、5％CO₂避光以及飽和濕度條件下培養48-96h；

采用流式細胞術檢測所述混合培養中的效應細胞的增殖細胞比例，以效應細胞增殖被抑制率評估待檢測干細胞制劑免疫調控功能，

效應細胞增殖被抑制率＝(對照孔增殖細胞比例均值-檢測孔增殖細胞比例均值)/對照孔增殖細胞比例均值×100％。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述效應細胞的分選采用T細胞分選試劑盒制備。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述CSFE染色標記效應細胞的過程包括：CSFE存儲液與PBS避光混勻，效應細胞以PBS重懸后與上述避光混勻的溶液迅速混勻；孵育、離心后去上清加入T細胞完全培養基中重懸；效應細胞以等體積的PBS重懸；且效應細胞的PBS重懸液與CSFE存儲液和PBS避光混勻液的混合體積為1:1；孵育條件為：室溫避光下孵育5min或4-10℃避光孵育；孵育、取300g離心5min后去上清加入2mL含10％FBS的T細胞完全培養基重懸。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述CFSE標記效應細胞的接種的過程包括：將CSFE標記效應細胞以加入了擴增磁珠的T細胞完全培養基重懸，接種于孔板中，每組安排2×3個效應細胞復孔；擴增磁珠顆粒數與CSFE標記的效應細胞數的比值為4:1-1:1；重懸后的細胞數目為5×10⁵-1×10⁶個細胞/mL；每孔細胞數目為1×10⁴-1×10⁵個細胞。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述含擴增磁珠的T細胞完全培養基的制備方法包括：在玻璃瓶中充分混勻重懸磁珠，立即吸取混勻后的磁珠至滅菌EP管，加入等體積或至少500μl基本培養基，離心去上清或置于MACS?STAND上，待磁珠被充分吸附到管壁后吸去液體，再以T細胞完全培養基重懸即可。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，采用流式細胞術檢測所述混合培養中的效應細胞的增殖情況包括：收集混合培養的細胞，充分吹打分散細胞和磁珠，于強磁場中收集細胞懸液，離心去培養基，以PBS重懸后流式上機檢測，選擇并分析CFSE陽性細胞即效應細胞的增殖細胞比例。