[發明專利]一種利用大腸桿菌高效表達并分泌人生長激素的方法

在審

• 申請號: 202010156578.1
• 申請日: 2020-07-21
• 公開（公告）號: CN111647607A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 陳劍清;王可盈;蓋其靜
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學紹興生物醫藥研究院有限公司;浙江理工大學;浙江清肽生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/18
• 分類號: C12N15/18;C07K14/61;C12N15/70;C12N1/21;C07K1/18;C07K1/34;C07K1/36;C07K1/14;C12R1/19
• 代理公司: 浙江納祺律師事務所 33257
• 代理人: 鄭滿玉

本發明公開的是一種能夠利用大腸桿菌高效表達并分泌人生長激素的方法，經過雙酶切后插入到載體pET28a(+)相應的酶切位點上得到pET28a?ST Ⅱ?hGH重組載體，工程菌：含有pET28a?ST Ⅱ?hGH重組表達載體的大腸桿菌，表達人生長激素蛋白：將含有pET28a?ST Ⅱ?hGH重組表達載體的大腸桿菌，培養、誘導，收集表達了人生長激素蛋白的菌體；純化重組人生長激素：菌體破碎、超濾、層析，加入核糖體結合位點避免使用昂貴限制性內切酶Nco Ⅰ，去除了pET28a(+)上多余序列，利用了載體原來的T7啟動子來啟動目的基因表達，常規載體實現人生長激素在大腸桿菌中的高效分泌表達，提高了生長激素的表達量。

技術領域

本發明涉及一種人生長激素的方法，更具體一點說，涉及一種利用大腸桿菌高效表達并分泌人生長激素的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

人生長激素(Human Growth Hormone,hGH)是由腦垂體側翼的成群排列的生長激素細胞(α細胞)分泌的一種單一肽鏈、非糖化的親水性蛋白質激素,含有191 個氨基酸殘基，分子量為21700Da，等電點為4.9。其主要作用是包括刺激骨、軟骨細胞的生長和分化，以及調節蛋白質、糖及脂肪的代謝等，臨床上主要用于治療侏儒癥，近年來研究發現hGH還可治療燒傷、創傷、骨折、骨質疏松、心血管疾病等多種疾病。生長激素缺乏是導致兒童生長障礙重要的因素之一。現在重組人生長激素在臨床上已廣泛應用。

最早的hGH(20世紀50～70年代)也稱為人垂體源性生長激素，它是從剛去世的人垂體中提取出來，是臨床上最早應用的生長激素。其缺點是：①來源受限，產量稀少；②純度較低，易產生抗體；③易受供體病毒污染，于1985年被美國FDA禁用。20世紀80年代早期：Genentech公司利用大腸桿菌(E.Coli) 包涵體技術研制出含192氨基酸的基因重組人生長激素——Met-rhGH，其缺點是：①提取和復性工藝復雜；②易受到污染；③與人hGH不完全一致，易產生抗體，純度和活性較低，因此也被淘汰，20世紀80年代中期，用普通大腸桿菌基因表達技術合成含有191個氨基酸的重組人生長激素，但由于其結構與人垂體生長激素具有差異，仍易產生抗體，另外其分泌和提取過程較為復雜，易受到污染或引入雜質而導致過敏反應，20世紀80年代末期，哺乳動物細胞重組DNA技術合成的含有191個氨基酸的重組人生長激素，該產品和天然的生長激素結構更為接近，但其缺點是：①細胞培養要求高、繁殖速度慢、收率低；②腺病毒污染——動物源性感染；③促增殖藥物污染——腫瘤發生，20世紀90年代，用分泌型大腸桿菌基因表達技術合成的重組人生長激素，產物直接分泌于菌體之外。其氨基酸含量、序列和蛋白質結構與人垂體生長激素完全一致，生物活性、效價、純度和吸收率極高，在最大限度降低治療成本的同時確保了產品的安全性、有效性和穩定性，但是目前大腸桿菌分泌表達存在表達量不高，操作復雜，有的超低溫表達對儀器設備要求較高等缺點，近年來也有利用酵母分泌表達hGH，可以大量表達hGH，但酵母表達周期長，培養基配置復雜，參數控制要求較高等缺點。

發明內容

針對現有技術的不足，本申請提供具有可提高生長激素的表達量，hGH更易于表達，成本低廉，易于實現等技術特點的一種利用大腸桿菌高效表達并分泌人生長激素的方法。

為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明提供一種重組人生長激素核苷酸序列，該核苷酸序列依次包含限制性酶酶切切位點1、核糖體結合位點、信號肽編碼區、人生長激素編碼區、限制性內切酶酶切位點2，其中，信號肽為大腸桿菌熱穩定腸毒素Ⅱ信號肽編碼序列 SEQ ID NO：1，hGH編碼序列為SEQ ID NO：2所示。

作為優選，限制性酶酶切位點1為-XbaI酶切位點，限制性內切酶酶切位點 2為xhoI酶切位點，核苷酸序列為SEQ ID NO：3。

另一方面提供一種重組表達載體，通過以下方法獲得：將核苷酸序列為SEQ IDNO：3經過雙酶切后插入到載體pET28a(+)相應的酶切位點上，得到pET28a-STⅡ-hGH重組載體。