[發明專利]一種用于檢測乙型肝炎病毒的試劑盒及其專用引物探針組

在審

• 申請號: 202010156498.6
• 申請日: 2020-03-09
• 公開（公告）號: CN111154920A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 柳輝;周保強;鄭文果;畢少輝
• 申請（專利權）人: 北京康美天鴻生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 何葉喧

本發明公開了一種用于檢測乙型肝炎病毒的試劑盒及其專用引物探針組。本發明提供了一種引物探針組，由序列表的序列1所示的引物F1、序列表的序列2所示的引物R1和探針P1組成；引物F1和引物R1均為單鏈DNA分子；探針P1為單鏈DNA分子，核苷酸如序列表的序列3所示。所述引物探針組的用途為如下(a)或(b)：(a)檢測生物樣本中是否含有乙型肝炎病毒；(b)通過檢測血漿中是否含有乙型肝炎病毒判斷受試者是否為乙型肝炎攜帶者。本發明的發明人在HBV突變頻率相對較高X區中發現一段保守的區域，設計了引物探針組，對于30IU/mL的樣本檢出率為100％，靈敏度高、特異性強、檢出率高，適用于篩選判斷乙型肝炎攜帶者，有助于乙肝的防控。

技術領域

本發明涉及一種用于檢測乙型肝炎病毒的試劑盒及其專用引物探針組。

背景技術

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個嚴重的公共衛生問題，我國屬乙型肝炎感染地方性流行區。根據2006年全國乙型肝炎流行病學調查，我國的慢性HBV感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例，每年因乙型肝炎導致的肝硬化和肝癌死亡約30余萬例，新發乙型肝炎病例約50萬～100萬例，乙肝防治是當前及今后相當長時間內要面臨的重要任務。

乙型肝炎是血源傳播性疾病，主要經血(如不安全注射等)、母嬰及性接觸傳播。急性HBV感染DNA存在先陽性后消失的發展過程，慢性HBV感染的自然史一般可分為4個期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動或低(非)復制期、再活動期，其中免疫耐受期HBV DNA滴度較高(大于20000IU/mL)，免疫清除期表現為血清HBV DNA滴度大于2000IU/mL，但一般低于免疫耐受期。非活動或低(非)復制期滴度較低(小于2000IU/mL)，部分再活動期患者表現為HBV DNA活動性復制，但并不是所有HBV感染者都經歷以上四期。

HBV已發現有9個基因型(A～I)，每個基因型又可分為不同亞型，且存在基因型之間的重組現象。我國已發現A、B、C、D基因型，中東部地區以B、C基因型占優勢，北方地區(長江以北)主要為C2亞型，南方大部分地區流行株為B2、C2、C1亞型并有少部分D基因型，西部地區尤其是新疆地區以D基因型為主，西部藏族居民中以C/D重組基因型為主，A型和B1亞型罕見。

HBV DNA定量檢測試劑是指利用包括實時熒光聚合酶鏈反應(polymerase chainreaction，PCR)或其他的分子生物學方法在內的核酸檢測技術，以HBV基因序列為檢測靶標，對人血清、血漿及其他人體樣本中的HBV DNA進行體外定量檢測的試劑。結合臨床表現和其他實驗室指標，HBV DNA定量檢測結果可作為乙型肝炎輔助診斷的指標之一，還可用于治療適應癥的選擇及抗病毒療效的判斷。

HBV基因組由4個開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)組成，分別是S區、P區、C區及X區。X區是HBV病毒基因組中最小的一個ORF，但卻是HBV基因組內功能重疊最明顯的區域，并且是HBV復制和擴散所必需要的基因。X區位于HBV基因組的第1374～1838位核苷酸(nt1374～1838)之間，全長465bp。

HBV復制的特點是RNA中間體的逆轉錄，由于逆轉錄酶跟RNA聚合酶缺乏矯正的功能再加上內外部的選擇壓力的作用，HBV DNA基因變異率較一般DNA病毒高10倍左右。目前市場上的HBV DNA檢測試劑一般針對HBV基因中保守率較高的基因區進行檢測，如S區、C區等。雖然這些區域較為保守，但也具有較低概率的變異，且不同亞型之間的序列也存在多態性。假如引物探針結合的堿基序列中存在變異或多態性，就有可能導致PCR擴增失敗而出現假陰性結果，影響對HBV感染的診斷及慢性乙型肝炎的治療。

對于HBV的檢測，現有方法還是存在靈敏度低，重復性差的問題，相對于較低水平的病毒載量(低于30IU/mL)往往不能準確地檢出。目前亟需一種高靈敏、高特異、重復性好、更加精進的HBV核酸的檢測方法，以指導慢性乙型肝炎的臨床治療。