[發明專利]一種廣譜型微藻口服疫苗及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010156447.3
• 申請日: 2020-03-09
• 公開（公告）號: CN111467484A
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 范建華;吳海珍;馬可;包秋文;施倩雯
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: A61K39/02
• 分類號: A61K39/02;A61P31/04;C12N15/79;C12N1/13;A23K50/80;A23K10/16;C12R1/89
• 代理公司: 上海華工專利事務所(普通合伙) 31104
• 代理人: 繆利明;趙孟琴

1.一種廣譜型微藻口服疫苗，其特征在于，其以糖酵解途徑來源的抗原蛋白作為抗原成分，所述糖酵解途徑來源的抗原蛋白在微藻中高表達。

2.如權利要求1所述廣譜型微藻口服疫苗，其特征在于，所述糖酵解途徑來源的抗原蛋白為ENO、PGM和PGK中的一種或多種；

所述ENO、PGM和PGK抗原蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQID NO：50所示。

3.如權利要求1所述廣譜型微藻口服疫苗，其特征在于，所述抗原蛋白為內部插入有rbcS2i基因的ENO和PGM的雙組合抗原蛋白，所述ENO和PGM抗原蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：48所示；所述rbcS2i基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：51所示。

4.如權利要求1所述廣譜型微藻口服疫苗，其特征在于，所述微藻包括萊茵衣藻、亞心形扁藻、青島大扁藻、雨生紅球藻、螺旋藻、小球藻、佐夫色綠藻、裂殖壺藻、等鞭金藻、綠色巴夫藻、三角褐指藻、鹽生杜氏藻、海鏈藻、菱形藻、角毛藻、集胞藻、聚球藻、念珠藻。

5.一種如權利要求1-4任一項所述的廣譜型微藻口服疫苗的應用，其特征在于，所述廣譜型微藻口服疫苗在防治水產養殖中的細菌性病害中的應用。

6.一種重組載體，其特征在于，包括ENO、PGM和PGK抗原蛋白中的至少一種，所述ENO、PGM和PGK抗原蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50所示。

7.如權利要求6所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體在微藻中高表達；所述重組載體為pUC-ENO、pUC-PGM、pUC-PGK、pOpt-ENO、pOpt-PGM、pOpt-PGK、pCG2-ENO、pCG2-PGM、pCG2-PGK、pPSC-ENO、pPSC-PGM、pPSC-PGK、pOpt-ENO/PGM、pOpt-ENO/PGK、pOpt-PGK/PGM、pOpt-4iENO/PGM中的一種，

所述pUC-ENO是通過將集胞藻PCC6803的上游同源臂、啟動子PpsbA、TrbcL終止子、下游同源臂以及將卡那抗性基因插入pUC-19質粒，再插入遲鈍愛德華氏菌EIB202的ENO基因后構建獲得；

所述pUC-PGM是通過將集胞藻PCC6803的上游同源臂、啟動子PpsbA、TrbcL終止子、下游同源臂以及將卡那抗性基因插入pUC-19質粒，再插入遲鈍愛德華氏菌EIB202的PGM基因后構建獲得；

所述pUC-PGK是通過將集胞藻PCC6803的上游同源臂、啟動子PpsbA、TrbcL終止子、下游同源臂以及將卡那抗性基因插入pUC-19質粒，再插入遲鈍愛德華氏菌EIB202的PGK基因后構建獲得；

所述pOpt-ENO是將遲鈍愛德華氏菌EIB202的ENO基因與不含Clover片段的pOpt載體片段拼接獲得；

所述pOpt-PGM是將遲鈍愛德華氏菌EIB202的PGM基因與不含Clover片段的pOpt載體片段拼接獲得；

所述pOpt-PGK是將遲鈍愛德華氏菌EIB202的PGK基因與不含Clover片段的pOpt載體片段拼接獲得；

所述pCG2-ENO是將遲鈍愛德華氏菌EIB202的ENO基因與pCG2-CpAR2質粒拼接獲得；

所述pCG2-PGM是將遲鈍愛德華氏菌EIB202的PGM基因與pCG2-CpAR2質粒拼接獲得；

所述pCG2-PGK是將遲鈍愛德華氏菌EIB202的PGK基因與pCG2-CpAR2質粒拼接獲得；

所述pPSC-ENO是將亞心型扁藻葉綠體片段16S-trnI、trnA-23S、亞心型扁藻葉綠體atpA的5’UTR、基因rbcL的3’UTR、草丁膦抗性基因bar基因、ENO基因與葉綠體遺傳轉化載體pPSC-bar連接獲得；

所述pPSC-PGM是將亞心型扁藻葉綠體片段16S-trnI、trnA-23S、亞心型扁藻葉綠體atpA的5’UTR、基因rbcL的3’UTR、草丁膦抗性基因bar基因、PGM基因與葉綠體遺傳轉化載體pPSC-bar連接獲得；

所述pPSC-PGK是將亞心型扁藻葉綠體片段16S-trnI、trnA-23S、亞心型扁藻葉綠體atpA的5’UTR、基因rbcL的3’UTR、草丁膦抗性基因bar基因、PGK基因與葉綠體遺傳轉化載體pPSC-bar連接獲得；

所述pOpt-ENO/PGM是將遲鈍愛德華氏菌EIB202的ENO基因、PGM基因與不含Clover片段的pOpt載體片段拼接獲得；

pOpt-ENO/PGK是將遲鈍愛德華氏菌EIB202的ENO基因、PGK基因與不含Clover片段的pOpt載體片段拼接獲得；

pOpt-PGK/PGM是將遲鈍愛德華氏菌EIB202的PGK基因、PGM基因與不含Clover片段的pOpt載體片段拼接獲得；

pOpt-4iENO/PGM是將遲鈍愛德華氏菌EIB202的ENO基因和PGM基因融合，獲得融合基因ENO/PGM，然后在融合基因ENO/PGM的內部人工合成插入rbcS2i基因，再與pOpt載體連接獲得；所述rbcS2i基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：51所示。