[發明專利]一種異源蛋白表達的滾環復制重組載體構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202010156017.1
• 申請日: 2020-03-09
• 公開（公告）號: CN111321167B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 余益成;孫健;李宗蕓
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66
• 代理公司: 江蘇斐多律師事務所 32332
• 代理人: 袁敏

本發明屬于生物技術及植物學領域，更具體的說屬于提供了一種用于異源蛋白表達的滾環復制重組載體的構建方法、重組載體及其應用。本申請通過提出的構建方法，構建了基于SPLCV序列為主的高效滾環復制瞬時表達載體，顯著提升了異源核酸及蛋白在植物上持續時間和表達豐度，其結果具有高度的可重復性和可靠性。本發明提供的重組載體具有對異源蛋白極長表達時間(20天相較于普通瞬時表達T載體)、極高表達豐度的載體(30倍表達，相較于普通瞬時表達T載體)的分子工具載體，賦予了不同植物(煙草，甘薯，牽牛)的異源蛋白表達能力，彌補了相關植物對于利用瞬時表達研究基因功能的空白。

技術領域

本發明屬于生物技術及植物學領域，更具體的說屬于開發了一種在不同植物進行異源蛋白高效瞬時表達的滾環復制重組載體的構建方法、重組載體及應用。

背景技術

利用植物進行異源蛋白表達是研究植物的通用研究技術，例如植物功能基因研究中通過使用模式植物(擬南芥、本氏煙)對非模式植物的未知基因進行表達從而驗證其基因功能；利用植物反應器(菠菜、煙草)對某些藥用蛋白進行表達并分離純化目的蛋白。通過分子克隆方式獲得具有能持續穩定進行外源基因表達的轉基因植物是進行異源蛋白表達的最好方式；但是因其載體構建復雜，轉化程序時間長(往往需要6-10個月)等因素影響，直接限制了該方法的使用。

構建帶有T-DNA插入區的瞬時表達載體是進行植物異源蛋白表達研究的備選方案，通過將構建完成的載體轉化農桿菌后利用注射器直接侵染植物，可以使注射區域在一段時間內穩定持續的表達目的蛋白，該方法操作簡單，時效性強，全部流程可能只需要10天左右即可完成；但是該方法也存在著一些固有缺陷，直接限制了該方法的使用：(1)持續時間短，蛋白的最長表達時間也僅能保持5-7天左右；(2).對較大分子量的蛋白表達能力差；(3)過量注射菌體容易導致超敏反應從而引起注射區域的枯萎壞死。

甘薯卷葉病毒(SPLCV；Sweet?Potato?Leaf?Curl?Virus)屬于雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬(Begomoviruses)是一種典型的單鏈環狀DNA分子病毒。

因此，提供一種新的構建植物異源蛋白表達重組載體的方法及重組載體以對目前植物異源蛋白表達研究具有重要意義。

發明內容

本發明提供了一種異源蛋白表達重組載體的構建方法、重組載體及其應用，該載體能對多種植物實現異源蛋白的高效瞬時表達。

為此，本發明提供了一種不同植物異源蛋白表達重組載體的構建方法，所述的構建方法采用了在普通T-DNA載體pCambia0390中插入甘薯卷葉病毒復制子基因，使其成為具有甘薯卷葉病毒復制子基因的滾環復制載體pCa-SPLCV-mid,其中預留了部分酶切位點作為異源基因連入表達的靶位點。

進一步的，所述的構建方法采用植物內源啟動子序列作為重組載體的啟動子，如pNbUBI.U4克隆自普通本氏煙基因組DNA；pIbCHIA、pIbUBI克隆自甘薯基因組DNA。

進一步的，所述的構建方法采用反向SPLCV-IL作為重組載體的串聯接頭，其基因序列如SEQ?ID?NO:4；采用SPLCV基因組非編碼區的部分序列構建終止子T-SPLCV-nIR，其基因序列如SEQ?ID?NO：6。

進一步的，所述的方法包括如下步驟：

步驟1)分別設計2對帶有接頭的克隆引物對SPLCV序列進行擴增，其中第一段擴增序列僅僅包括SPLCV-IL區域，第二段擴增序列包含SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR；

步驟2)：將克隆獲得的PCR產物純化后分別連接進入預先利用限制性內切酶HindIII/BamHI酶切后的pCambia0390中，獲得命名為pCambia0390-SPLCV-mid的中間載體，連接方法為同源重組連接；