[發(fā)明專利]一種檢測前列腺癌的試劑盒及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010155821.8
• 申請日: 2020-03-09
• 公開（公告）號: CN111394455A
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王宏婷;許忠建;陳升;馬躍新;費永強;張曉宇;劉森寧;賀良;王思怡;胡唐彬
• 申請（專利權(quán)）人: 皖南醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6848;C12N15/11
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11308
• 代理人: 范奇

1.一種檢測前列腺癌的試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟，

引物設(shè)計和合成：遵循PCR引物設(shè)計原則，參照Genebank提供的PCA3基因、PSA基因、PSMA基因和TMPRSS2:ERG基因的DNA保守區(qū)序列，分別設(shè)計一對外鏈引物，根據(jù)外鏈引物擴增所得產(chǎn)物設(shè)計一對內(nèi)鏈引物，根據(jù)內(nèi)鏈引物擴增所得產(chǎn)物設(shè)計一對轉(zhuǎn)錄引物；

目標(biāo)基因cDNA的巢式擴增：外鏈引物擴增cDNA，得到產(chǎn)物1，將產(chǎn)物1稀釋后用內(nèi)鏈引物進行擴增，對擴增產(chǎn)物稀釋后，得產(chǎn)物2；向產(chǎn)物2中加入TMA反應(yīng)體系進行混合反應(yīng)后，離心10～20s后，進行孵育；

檢測：將孵育產(chǎn)物稀釋后在260和280nm下，測試吸光度，定量PCA3、PSA、PSMA和TMPRSS2:ERG的mRNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測前列腺癌的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述方法還包括樣本的提取，所述樣本的提取，離心收集的尿液，取下層尿液沉渣進行PBS洗滌后，再離心，棄上清，得前列腺癌細胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測前列腺癌的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述方法還包括樣本RNA模板制備步驟，所述樣本RNA模板制備，將前列腺癌細胞制成細胞懸液，一次離心5～20min后，將離心物室溫放置3～10min，加入氯仿震蕩混勻后，室溫放置90～150s，二次離心10～25min，取上層水相，加入異丙醇混勻后，室溫沉淀8～25min，三次離心5～20min后，加入乙醇混勻后，四次離心2～10min，向離心物中加入DEPC至離心物完全溶解，凍存。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測前列腺癌的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述一次離心、二次離心和三次離心的條件均為9000～20000g，1～7℃，所述四次離心的條件為6500～10000g，1～7℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測前列腺癌的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述PSMA基因的外鏈引物：

Forward5’-TCACCGGGACTCATGGGTGT-3’；

Reverse5’-GCCTGAAGCAATTCCAAGTCG-3’；

內(nèi)鏈引物：

Forward5’-AAGGAAGGGTGGAGACCTAG-3’；

Reverse5’-ACTGAACTCTGGGGAAGGAC-3’；

轉(zhuǎn)錄引物：

Forward5’-TAATACGACTCACTATAGGTAGAAGGAAGGGTGGAGACCTAG-3’；

Reverse5’-TAATACGACTCACTATAGGTAGACTGAACTCTGGGGAAGGAC-3’。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測前列腺癌的試劑盒的制備方法，其特征在于，所述PCA3基因的外鏈引物：

Forward5’-AGTCCGCTGTGAGTCT-3’；

Reverse5’-CCATTTCAGCAGATGTGTGG-3’；

內(nèi)鏈引物：

Forward5’-ATCGACGGCACTTTCTGAGT-3’；

Reverse5’-TGTGTGGCCTCAGATGGTAA-3’；

轉(zhuǎn)錄引物：

Forward5’-TAATACGACTCACTATAGGTAGATCGACGGCACTTTCTGAGT-3’；

Reverse5’-TAATACGACTCACTATAGGTAGTGTGTGGCCTCAGATGGTAA-3’。