[發明專利]一種牛屬動物線粒體基因組捕獲探針試劑盒

在審

• 申請號: 202010153348.X
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111172159A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 向海;趙興波;張興
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京八月瓜知識產權代理有限公司 11543
• 代理人: 李斌

1.一種牛屬動物線粒體基因組捕獲探針試劑盒，其特征在于，包括探針的構建，所述探針根據牛屬動物線粒體基因經過DNA序列設計獲得，所述探針的構建包括將各牛屬動物的擴增產物等質量混合；將混合后各牛屬動物的擴增產物使用超聲波破碎儀進行打斷處理；將合成的生物素標簽和磷酸化引物進行PCR擴增標記及酶切。

2.一種牛屬動物線粒體基因組捕獲的方法，其特征在于，所述方法利用權利要求1所述的探針進行捕獲和測序分析。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

1).長片段擴增引物的設計

從NCBI數據庫中收集牛屬動物的參考線粒體基因組序列，并通過多重比對篩選保守區域，利用引物在保守區域上設計特定的牛屬動物線粒體基因組通用長片段擴增引物，且擴增產物長度分別為8892bp和7966bp；

2).線粒體基因組擴增以及PCR產物回收

采用所述長片段擴增引物分別擴增不同牛屬種的DNA，且PCR程序設置需要經過預變性、變性、退火、延伸、循環的操作，后將各擴增陽性產物使用不同的瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒進行純化，備用；

3).探針的構建

a.將各瓊脂糖凝膠純化回收的產物分別進行濃度檢測，后等質量混合；

b.往等質量混合后的產物加適當的雙蒸水，使用超聲波破碎儀進行打斷處理，且所述打斷處理的條件為：打斷15s間歇30s，7個循環；

c.配置末端修復混合物，按照體積比為8:7:5的雙蒸水、End Repair Buffer、EndRepair Enzyme Mix添加至混合裝置中，渦旋混勻，與片段化的樣品混勻得到溶液，置于混勻儀中20℃孵育30min，得到末端修復混合物；

d.往步驟c中的末端修復混合物中加入磁珠，渦旋混勻，室溫放置10min后，將樣品轉移到磁力架上3-5min，待液體澄清后移除廢液，繼續添加80％酒精溶液沖洗30s，移去廢液，重復清洗2次，開蓋2-3min使酒精揮發；

e.將體積配比為42:5:3的雙蒸水、A-Tailing Buffer、A-Tailing Enzyme依次加入混合裝置中，并添加至步驟d中，渦旋混勻，置于混勻儀30℃孵育30min；

f.按照體積比，往步驟e中加入2倍量的PEG/NaCl溶液，渦旋混勻，室溫放置10min后，將樣品轉移到磁力架上，待液體澄清后移除廢液，繼續添加80％酒精溶液進行沖洗，移去廢液，重復清洗2-3次，并使酒精揮發，得到混合物A；

g.按照體積比為32:10:5的雙蒸水、Ligation Buffer以及DNA ligation依次添加至混合裝置中，得到混合物B，并將混合物B轉移至步驟f中的清洗后的混合物A中，并加入占混合物B體積3/47的Adapter，后置于恒溫混勻儀中20℃孵育15min；

h.往步驟g中加入適量的PEG/NaCl溶液，渦旋混勻，室溫放置10min后，轉移到磁力架上，待液體澄清后移除廢液，繼續添加80％酒精溶液沖洗，移去廢液，重復清洗2-3次，并使酒精揮發；后加入雙蒸水進行溶解，室溫放置5-10min后移至磁力架上，并取上清液；

i.進行文庫擴增以及擴增后的清洗；

j.將擴增清洗后的產物電泳條件下切取200-300bp位置的瓊脂糖凝膠片段使用OMEGA試劑盒進行回收，并測濃度；

k.進行擴增標記以及磁珠純化操作；

l.按照體積比5:1.5取10×NEB Buffer以及限制性內切酶，補充雙蒸水進行定量，后利用渦旋混勻后置于PCR儀中37℃孵育1h，完成第一次酶切；按照體積比5:1取10×NEBBuffer以及限制性內切酶，并補充雙蒸水進行定量，置于PCR儀中37℃孵育3h，完成第二次酶切。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述牛屬動物的牛線粒體基因組全長為15-17kb。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物包括F引物以及R引物。