[發明專利]一種高產胞苷酸的重組大腸桿菌及其應用

在審

• 申請號: 202010152381.0
• 申請日: 2020-03-06
• 公開（公告）號: CN111269870A
• 公開（公告）日: 2020-06-12
• 發明（設計）人: 王昕;王靜;陳可泉;馬琛;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/54;C12N15/70;C12P19/30;C12R1/19
• 代理公司: 南京先科專利代理事務所(普通合伙) 32285
• 代理人: 葉帥東

1.一種高產胞苷酸的重組大腸桿菌，其特征在于，以大腸桿菌MG1655為來源，復制胞苷激酶基因，并構建到大腸桿菌BL21（DE3）中，即得重組大腸桿菌UCK；所述胞苷激酶基因的核苷酸序列如SCN NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的一種高產胞苷酸的重組大腸桿菌，其特征在于：選取引物，通過PCR復制大腸桿菌MG1655上的腺苷酸環化酶基因，再與載體pET28a連接，并轉入克隆載體Trans1-T1，經過LB平板初篩后，挑點進行菌落PCR驗證后測序。

3.根據權利要求2所述的一種高產胞苷酸的重組大腸桿菌，其特征在于：所述引物中上游引物帶有Nco I 酶切位點，下游引物帶有EcoR I 酶切位。

4.一種高產胞苷酸的重組大腸桿菌在合成環磷酸腺苷上的應用。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，培養重組大腸桿菌UCK至OD₆₀₀至0.5~0.7時，加入IPTG 至終濃度0.5‰~1‰，20~30℃下誘導表達13~15h后破碎，收集上清液即粗酶液并測蛋白濃度；向蛋白濃度為6~8g/L的胞苷激酶粗酶液中加入濃度為30~35 mM 胞苷、30~35 mM 的三磷酸腺苷、8~10mM MgCl₂、磷酸鉀緩沖液，攪拌均勻后在pH7.5~8.0、35~37℃條件下反應7~9 h，完成酶促反應合成胞苷酸。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，挑選重組大腸桿菌UCK至 LB/KanR 培養基中，在37℃、200rpm 條件下振蕩至OD₆₀₀≈1，然后轉接至新鮮LB/KanR 培養基中繼續培養至OD₆₀₀≈0.5~0.7。